PDF《临床组织样本》

临床组织样本 western blotting 张晓红 2018-06-20 临床组织样本处理 对蛋白质进行定量 Western Blotting 临床组织样本处理 1.

临床组织样本包括心肝脾肺肾以及脑组织等,由于血液中成分比较复杂,为 避免其对结果的影响,在收集样本时需要将组织中的血液尽量排尽;

2. 将组织至于研钵中,用剪刀将组织尽量剪碎,再放入适量的液氮,并迅速用 钵杵研磨组织,用RIPA裂解液裂解组织.对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml RIPA裂解液,肺100~200mg加1ml RIPA裂解液.可用移液器反复吹打,或者 将组织和裂解液的混合液放在振荡器上振荡以组织得到充分裂解.过程中须尽量 保持低温,快速操作. 3. 裂解后,将裂解液移1.5ml 离心管中,于4℃离心机中,12000rpm离心20min, 取上清分装于0.5ml 离心管中并Z于-20 ℃保存(-80℃长期保存). RIPA裂解液:可购买,也可自己配制 配方: 试剂 浓度 Tris碱50mmol/L, PH7.5 氯化钠 150mmol/L SDS 0.1% EDTA 1mmol/L NP-40 1% 去氧胆酸钠(deoxycholate) 1% RIPA裂解液(强) RIPA裂解液(中) RIPA裂解液(弱) 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS 1% NP-40, 0.5% deoxycholate 1% NP-40, 0.25% deoxycholate 使用时还需要加入蛋白酶抑制剂等防止蛋白质降解 对蛋白质进行定量 BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)―碧云天 ,货号 为P0009 产品编号 产品名称 包装 P0009-1 BCA试剂 A 500ml*2 P0009-2 BCA试剂 B 30ml P0009-3 蛋白标准(BSA) 30mg*2 P0009-4 蛋白标准配制液 5ml 1. 蛋白标准品的准备 a. 取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中,充分溶解后配制 成25mg/ml的蛋白标准溶液.配制后可立即使用,也可以-20℃长期保存. b. 取适量25mg/ml蛋白标准,稀释至终浓度为0.5mg/ml.例如取20? l 25mg/ml蛋白 标准,加入980? l稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准.蛋白样品在什么溶液中, 标准品也宜用什么溶液稀释.但是为了简便起见,也可以用0.9% NaCl或PBS稀释 标准品.稀释后的0.5mg/ml蛋白标准可以-20 ℃长期保存. 2. BCA工作液的配制 根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作 液,充分混匀.例如5ml BCA试剂A加100?l BCA试剂B,混匀,配制成5.1ml BCA工作液.BCA工作液室温24小时内稳定. 3. 蛋白浓度检测 a. 将标准品按

0、

1、

2、

4、

8、

12、

16、20? l加到96孔板的标准品孔中,加标准 品稀释液补足到20? l,相当于标准品浓度分别为

0、0.

025、0.

05、0.

1、0.

2、0.

3、 0.

4、0.5mg/ml. b. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中.如果样品不足20? l,加标准品稀释液补 足到20? l.请注意记录样品体积. c. 各孔加入200? l BCA工作液,37? C放Z20-30分钟. 注: 也可以室温放Z2小时,或60? C放Z30分钟.BCA法测定蛋白浓度时,颜色会 随着时间的延长不断加深.并且显色反应会因温度升高而加快.如果浓度较低, 适合在较高温度孵育,或适当延长孵育时间. d. 用酶标仪测定A562,或540-595nm之间的波长的吸光度,562nm最佳. e. 根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度. Western Blotting 胶的制备 上样 电泳 封闭 孵育二抗 显影 转膜 孵育一抗 结果分析 胶的制备 ? 清洗玻璃板、胶条;

? 检漏:用超纯水;

? 配制分离胶:用水或者异丙醇液封,大 概需要30min~1h;

? 配制浓缩胶:15孔或者10孔梳子,梳 子的厚度为10mm或者15mm,大概需要 15~30min;

分离胶 根据目的蛋白的分子量大小 选择合适的凝胶浓度,再按 照下面的表格配制SDS- PAGE的分离胶(即下层胶): 不同浓度的SDS-PAGE分离 胶的最佳分离范围 如果配制非变性胶,参考分 离胶配方,分离胶中不加 10%SDS即可配制成非变性 PAGE胶. 浓缩胶 http://www.cytographica.com/lab/acryl2.html 上样 1. 配制好的聚丙烯凝胶放Z于电泳槽中,并向电泳槽中加入适量的电泳缓冲液;