PDF《产品简介》

riboAPOTM One-Step TUNEL Apoptosis Kit (Red) RN:R11089.

1 产品简介 细胞凋亡是高度有序的细胞死亡过程,对生物的正常发育和内稳态至关重要.细胞凋亡的特征之一是断裂基因 组DNA 片段暴露出的 3? -羟基(3? -OH) .本试剂盒采用 TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling(TUNEL)方法, 经TdT 酶催化作用,在DNA 的3? -OH 末端催化掺入 TAM-dUTP,使用荧光显微镜直接观察即可快速检测细胞凋亡 状况.本试剂盒适用于体外培养细胞和组织切片(冰冻切片或石蜡切片)细胞的凋亡检测. 试剂盒内容 注:试剂 C 有一定毒性,注意佩戴手套口罩避免皮肤接触. 运输与保存 低温运输,-20?C 储存,荧光试剂请避光保存,按照建议条件保存可稳定储存一年. 使用前需瞬时离心,以免损失. 组分 试剂内容 浓度 C11026-1 (20T) C11026-2 (100T) C11026-3 (500T) 试剂 A TAM-dUTP Mixture(Red) 50μM 50μL 250μL 1.25mL 试剂 B TdT Enzyme 20U/μL 20μL 100μL 500μL 试剂 C 5X TdT Buffer 5X 400μL 2mL 10mL 试剂 D 100X DAPI 100X 20μL 100μL 500μL 电话咨询:

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3 实验方法(以96 孔板培养,Hela 贴壁细胞为例) 实验准备 ? 1X PBS (pH 7.2~7.6) ? 4% 多聚甲醛(PBS 配制) ? 渗透剂(含0.5% Triton X-100 的PBS) ? 十字孢碱或 DNase I(用于阳性对照制作) ? 2X SSC (pH 7.0) 实验步骤 1. 细胞培养 取对数生长期细胞,以每孔 4X103 ~1X105 细胞接种于

96 孔板中,培养至正常生长阶段.细胞数量根据丌同细 胞系及细胞生长情况而定,实验前细胞密度达到 70%~80%为宜.接种细胞时多接种几孔用于阳性对照及阴性对照 样品制备. 2. 药物处理 (可选)客户可以根据实验需要进行各种药物处理. 3. 阳性对照制作 3.a 使用十字孢碱(在细胞固定化之前) 细胞凋亡模型可以使用十字孢碱(Staurosporine,STS)处理

24 小时(终浓度 0.25-2μM),根据丌同细胞系 需要优化具体处理浓度和处理时间,一般细胞轻微皱缩即可,处理时间丌宜过长,防止细胞脱落. 3.a.1 弃去原有细胞培养基,用1X PBS 小心清洗细胞(如果细胞贴壁能力较弱,可直接进行加药处理);

3.a.2 加入含十字孢碱的新鲜培养基(终浓度 0.25~2μM),置于 37° C,5% CO2 培养箱中孵育

24 小时. 3.b 使用 DNase I(在细胞固定化之后) 3.b.1 制备 DNase I 酶混合处理液,每孔取 DNase I 酶1μL(5U/μL),DNase I 酶缓冲液 5μL,加入 44μL 去离子水中,混合均匀;

3.b.2 每孔加入 50μLDNase I 酶混合处理液,室温孵育 0.5~3 小时;

3.b.3 弃去 DNase I 酶混合处理液,每孔加入 100μL1X PBS 清洗

2 次,每次

5 分钟. 4. 阴性对照制作 采用 Buffer 代替 TdT 酶即可作为阴性对照组. 5. 细胞固定化 5.1 弃去细胞培养基,用1X PBS 小心清洗弃去(如果细胞贴壁能力较弱,可直接进行固定步骤);

5.2 每孔加入 100μL 细胞固定液(含4%多聚甲醛的 PBS)室温孵育

15 分钟,弃固定液;

5.3 每孔加入 100μL 去离子水,孵育

5 分钟后,弃去离子水;

5.4 (加强通透)每孔加入 100μL 渗透剂(含0.5% Triton X-100 的PBS),室温孵育

10 分钟,弃去渗透剂 电话咨询:

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3 使用去离子水清洗两次,每次

5 分钟. 6. TdT 酶连反应 6.1 5X TdT Buffer(试剂 C)在使用前请用去离子水稀释至 1X TdT Buffer;

6.2 每孔用 50μL1X TdT Buffer 覆盖细胞,室温下放置 5~10 分钟;

6.3 在平衡细胞的同时,在冰上解冻 TAM-dUTP Mixture(试剂 A),且依照下表准备足量的 TdT 孵育缓冲 液;

表150μL 的TdT 酶孵育液配制参考 注:将试剂 A 和TdT 酶孵育缓冲溶液需放置于冰上,避光. 6.4 弃去 1X TdT Buffer,每孔加入 50μL TdT 酶孵育液,37° C 避光孵育

2 小时;

6.5 每孔加入 100μL 2X SSC,室温放置

15 分钟以终止反应,弃SSC;

6.6 加入适量 1X PBS,放置在脱色摇床或轻轻晃动样品清洗

2 次,每次

5 分钟. 7. DNA 染色 7.1 用去离子水稀释 100X DAPI 荧光染料, 制备适量 1X DAPI 反应液,避光保存;

7.2 每孔加入 100μL 1X DAPI 反应液,室温、脱色摇床避光孵育 10~30 分钟后,弃染色反应液;

7.3 每孔加入 100μL 1X PBS 清洗 1~3 次,每次

5 分钟;

7.4 客户可选择进行其他染色步骤,否则每孔加入 100μL 1X PBS 保存待用. 8. 其他染色(自备) (可选)客户可以根据实验需要进行细胞表面或细胞内抗原的抗体染色. 9. 图像获取及分析 建议染色完成后立即置于荧光显微镜进行观测,最大激发波长为 560nm(红色荧光);

如果条件限制,请避光 4℃湿润保存待测,但丌应超过

3 天. 顺序 缓冲液成分 各组分体积

1 1X TdT Buffer 46.5μL

2 TdT Enzyme(试剂B)

1 μL

3 TAM-dUTP Mixture(Red)(试剂A) 2.5μL