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3 US EVERBRIGHT? INC.

技术支持: 0512-88965152 www.useverbright.com 产品说明书产品名称: Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live &

Dead Cells(Calcein AM, EthD-I 法) 产品货号:L6023 产品规格:150T , 300T 产品内容: 组分 L6023 (150T) L6023 (300T) A : Calcein AM (4 mM in anhydrous DMSO)

50 μL

100 μL B : Ethidium homodimer-1(EthD-I) (2 mM in DMSO/H2O 1:4(v/v))

150 μL

300 μL 储存条件 -20?C 避光保存,六个月有效.注意 Calcein AM 容易水解,需密封干燥保存,稀释工作液需当天配制.EthD-I 在-20?C 保存,一年有效. 产品介绍 Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live &

Dead Cells 是一种为动物细胞死活检测提供双荧光染色的试剂盒. 试剂盒内的两种探针可分别测定细胞内酯酶活性和质膜完 整性从而反映细胞活力. 本试剂盒可用于荧光显微镜、 流式 细胞仪、酶标仪以及其他荧光检测系统. Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live &

Dead Cells 可以应用于大多数的真核哺乳动物细胞,包括贴壁细 胞核的某些组织, 但不适用于真菌和酵母. 该试剂盒与相同 用处的台盼蓝相比,更快捷安全且灵敏度更高. 使用方法 荧光显微镜检测 1. 准备工作液 准备

2 μM Calcein AM 和4μM EthD-I 的染色工液: 取出Calcein AM和EthD-I原液, 使其恢复室温. 将20 μL

2 mM EthD-I 和5μL

4 mM Calcein AM 与10 mL PBS 或其他无 血清缓冲液或培养基混合, 涡旋混匀. 上述工作液可直接用 于细胞染色. 注: Calcein AM 的水溶液易水解,应当天用完. Calcein AM 和EthD-I 的浓度选择依据所用细胞类型不同而 有所区别,推荐浓度范围为 0.1~10 μM. 2. 准备细胞并开展实验 2.1. 对于贴壁细胞,先用胰酶-EDTA 消化细胞,离心收集 细胞(1000rpm,3min) .对于悬浮细胞,直接离心收集细 胞. 2.2. 用1* PBS 充分清洗细胞 2~3 次,以充分去除残留的酯 酶活性. 2.3. 对于贴壁细胞,加入足够量的 Calcein AM/EthD-I 染色 工作液.对于悬浮细胞,加入适量的染色工作液,使细胞密 度控制在 1- 5*105 /mL. 2.4. 37℃孵育

15 min ~

20 min(如果工作液浓度较高或者孵 育温度较高,应适当的减少孵育时间). 2.5. 荧光显微镜下观察标记的细胞.

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3 US EVERBRIGHT? INC. 技术支持: 0512-88965152 www.useverbright.com 流式细胞仪检测 1. 取出试剂,恢复至室温. 2. 准备

2 μM Calcein AM 和4μM EthD-I 的染色工作液:取出Calcein AM 和EthD-I 原液,使其恢复室温. 将20 μL

2 mM EthD-I 和5μL 4mM Calcein AM 与10 mL PBS 或其 他无血清缓冲液或培养基混合, 涡旋混匀. 上述工作液可直 接于细胞染色. 3. 用1* PBS 充分清洗细胞 2~3 次. 4. 用0.5 mL 染色工作液悬浮细胞,控制细胞密度为 1-5*105 /mL. 注:我们推荐准备两管额外的样品,每管只加入一种 染料(Calcein AM 和EthD-I) ,用于流式单染的补偿调节. 5. 室温避光孵育 15-20 min. 6. 在1-2 h 内,通过流式细胞仪检测细胞活性.Calcein AM 可以由

488 nm激光激发, 检测荧光发射光谱约在

530 nm处, EthD-I 发射光谱约在

610 nm 处. 注:细胞圈门时,注意排除细胞碎片,使用单染管调 节补偿, 双染管流式检测应获得两个相对独立的细胞群: 显 示绿色荧光的活细胞群和红色荧光的死细胞群. 酶标仪检测 1. 在96 孔板中培养适量的贴壁或悬浮细胞. 注: 用1%的皂苷 0.1-0.5%洋地黄皂苷处理细胞

10 min, 即可得到死细胞. 2. 准备

2 μM Calcein AM 和4μM EthD-I 的染色工作液: 取出 Calcein AM 和EthD-I 原液, 使其恢复室温. 将20 μL

2 mM EthD-I 和5μL

4 mM Calcein AM 与10 mL PBS 或其 他无血清缓冲液或培养基混合,涡旋混匀. 注:10 mL 的染色液足够染色一个

96 孔板,可根据实 验需要调整染色液的体积.Calcein AM 和EthD-I 的浓度可 在0.1~10 μM 之间摸索. 注: Calcein AM 的水溶液易水解, 应当天用完.EthD-I 工作液可保存在-20℃,至少可保存一年. 3. 用1* PBS 充分清洗细胞,以充分去除残留的酯酶活性. 对于贴壁细胞,每孔加

100 μL PBS 清洗细胞.对于悬浮细 胞,加100 μL PBS 重悬细胞,离心分离细胞.重复上述操 作. 4. 每孔中加入

100 μL PBS. 5. 每孔中加入

100 μL染色工作液, 使每孔总体积为

200 μL, Calcein AM 的终浓度为

1 μM, EthD-I 的终浓度为

2 μM.轻 轻摇晃培养板,使液体均匀覆盖细胞. 6. 室温避光孵育 30~45 min. 7. 酶标仪检测.当酶标仪设置为 fluorescein 时,可以检测 Calcein AM;

当酶标仪设置为 rhodamine 或Texas Red 时, 可以检测 EthD-I. 根据光谱特性选择最佳的发射及激发波长. 注:通过对比样品组与对照组测量的Relative fluorescence values (RFU),可以得出死细胞与活细胞数量的 变化.下面也提供了另一种数据分析的方法. 计算某个区域活细胞与死细胞的比例 下面方法可以计算出死细胞与活细胞的比例. 需要的 样品有死细胞对照组、活细胞对照组及要测的样品组.用1%的皂苷或 0.1- 0.5%洋地黄皂苷处理细胞 10min, 即可得 到死细胞. 1. 准备染色工作液及按上述步骤染色细胞.另外,分别准 备1mL

2 μM Calcein AM 和4μM EthD-I 溶液,按照下列 指示来染色对照组. 2. 样品组及对照组测量: A. 样品组在645nm 的测量值, 记为 Calcein AM 和EthD-I=F(645)sam. B. 样品组在

530 nm 的测量值,记为 Calcein AM 和EthD-I=F(530)sam. C. 死细胞 EthD-I 单染对照组在

645 nm 的测量值,记为 EthD-I=F(645)max. D. 死细胞 Calcein AM 单染对照组在

645 nm 的测量值,记为Calcein AM=F(645)min. E. 活细胞 EthD-I 单染对照组在

530 nm 的测量值,记为 EthD-I=F(530)min

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3 US EVERBRIGHT? INC. 技术支持: 0512-88965152 www.useverbright.com F. 活细胞 Calcein AM 单染对照组在

530 nm 的测量值,记为Calcein AM=F(530)max. G. 没有细胞的空白对照孔(加染料或不加染料均可), 530nm 处的检测值记为 F(530)0. H. 没有细胞的空白对照孔(加染料或不加染料均可), 645nm 处的检测值记为 F(645)0. 3. 根据测量数据计算死细胞与活细胞的比例: % Live Cells = (B - E) ÷(F - E) % Dead Cells = (A - D) ÷(C - D) 确定某个区域活细胞与死细胞的比例 通过制作

530 nm 和645 nm 处的荧光光谱标准曲线, 可以确定死细胞与活细胞的数量, 每个染料的荧光强度分别 与样品中死细胞或活细胞的数量成直线型关系. 相关产品 货号 产品名称 C6003-200T Calcein AM Cell Viability Assay Kit C6003-1000T C6005-100T Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒 C6005-500T C6005-3000T L6037-150T Viability/Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live &

Dead Cells(Calcein AM, PI 法) L6037-300T L6060-100T Viability/Cytotoxicity Assay for Bacteria Live &

Dead Cells P4036-1mg PMA ........