PPT《第三章 免疫组织化学 前言 免疫组织化学（...》

第三章 免疫组织化学 前言 免疫组织化学(Immunohistochemistry)又称免疫细胞化学.

它 是组织化学的分支,它是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行组织和细胞原位检测技术. 1.发展简史――1941年Coons 首先用荧光素标记抗体―检 测肺组织内的肺炎双球菌获得成功.―― 60年代 Nakane建立酶标抗体技术――铁 蛋白标记Ab技术.―― 70年代 Stemberger 改良上述技术,建立 辣根过氧化物酶――抗体过氧化物酶(PAP )技术,使免疫细胞化学得到广泛应用. ―― 80年代 Hsu 等建立了抗生物素―生素(ABC) 法之后,免疫金―银染色法、半抗原标记法、 免疫电镜技术相继问世.―― 90年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细 胞化学分类方法迅速发展.――2000年 各种免疫组化技术更加成熟,使免疫组 化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综 合研究的一项有力工具.其应用范围深达医学各 个学科,是目前生 命科学工作者应 该掌握的基 本技术之一. 2.免疫组织化学的技术分类(1)根据染色方式分成:① 贴片染色 ② 漂浮染色(2)根据Ag―Ab结合方式分成:直接法 ② 间接法 ③ 多层法 (3)按标记物的性质分成:免疫荧光技术(免疫荧光法)免疫酶技术(酶标抗体法、桥法、PAD 法、 ABC法)免疫金属技术(免疫铁蛋白法、免疫金 染色法、蛋白A金法)3.标记物(1)必要性:组织细胞内Ag―Ab结合反应一 般是不可见的,若在镜下检测,则必须 具有可视性标记物. (2)常用标记物 ① 荧光素:最常用的是异硫一氰酸荧光 素(Fluorescein isothiocyanate FITC) ―― 荧光显微镜下呈绿色荧光 四乙基罗达明(rho―damine RB200)荧光显微镜下发橙红色荧光 ② 酶:辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶.生物素:(Biotin)铁蛋白金等:主要应用于免疫电镜.其他:如同位素(因涉及污染和防护 难一般不用) 4.应用 凡是组织细胞内具有抗原性的物质,如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示,因而目前在基础与临床科研中被广泛应用.最近几年,分子生物学研究异常活跃,但最终还要归到形态上来.用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位,进而深入研究其功能.

一、免疫组织化学技术

(一)染色方法1.直接法 荧光素直接标记特异性抗体(―抗) 上,标记抗体与抗原结合(在切片上) 荧光显微镜下观察→检测抗原. 酶标抗体要显示后镜检. 直接法优点:简单,时间短,特异性强.缺点:灵敏度低,所需抗体量大(不经济).应用:基本不用了!! 2.间接法 荧光素标记在二抗上(二抗:抗产生一抗动 物的 IgG抗体).显色后镜检 特点:较直接法灵敏,可标记一种抗体→鉴定多种抗原. 3.非标记Ab桥法:桥法 是酶标记抗体的改进,经过三次抗体,其二抗为未标记桥抗体.(1)单桥法 (2)双桥法 在三抗之后,将二抗和三抗再重复一次, 可增大染色强度. 特别提示:注意动物种属关系4.PAP法(过氧化物酶―抗过氧化物酶法 Peroxidase anti―peroxidase method, PAP法)是桥法的改良,既先形成PAP复合物→抗原―抗体―抗IgG抗体―PAP复合物. 该法简化了操作步骤,提高了灵敏度,所染标本可长期保存.5.ABC法(亲和素―生物素―过氧化物酶复 合物法,Avidin―biotin―peroxidase Complex method,ABC法) Avidin: 亲和素,一种糖蛋白,其上有4个 与生物素相结合的位点. Biotin : 生物素―维生素H,两者亲和力巨 大,牢不可破. (1)ABC复合物的制备: ABC法与PAP法的区别是:以ABC复合物代替PAP复合物. (2)ABC法反应原理 6.SP或SAP法(过氧化物酶标记的链霉卵 白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染 色)Streptavidin/peroxidase or strepta- vidin/alkaline phosphatase) 该法是ABC法基础上的进一步改良,使卵白 素与链霉(而非生物素)结合,而后再结 合PO . 它有4个亚基可与生物素结合,灵敏特异, 背景低,成本低. 现在还有plus盒.优点是:更简便,放大倍数↑,等电点中性更适合组织.分子量小,穿透力↑,原理保密.7.蛋白A―金法(Protein―A gold method) ~多用于电镜8.双重组化染色法 应用双重免疫组织化学激素可在同一张切片,同一细胞或亚细胞结构内同时显示两种不同的抗原. 9.免疫金―银染色法 (Immunogold―silver staining IGSS)