PPT《第三章 免疫组织化学 前言 免疫组织化学（...》

(二)固定――见前述注意事项:1.固定剂的选择:因组织而不同,注意质量和 性能.2.固定方式的选择:① 浸渍固定(参考文献)灌注固定(+后固定)蒸汽固定

(三)免疫组化染色步骤(以ABC法为例)1.切片脱蜡入水,入PAS 洗三次/15分钟.2.封闭内源性过氧化物酶. 用新配置的0.3%H2O2 (在PAS或0.05Tris― HCL缓冲液PH7.6中或甲醇中)室温,30 分钟.3.水洗,入PBS,洗三次,每次5分钟.4.减少非特异性着色 用稀释20倍的正常血清(产生二次抗体动物 血清!),室温,30分钟.5.滴加第一抗体,4℃过液或室温5′~1 hour.6.0.1MPBS,洗三次,每次5分钟.7.滴加第二抗体,室温15′~ 60′.8.0.1MPBS 洗净,洗三次,每次5分钟.9.滴加ABC复合物,室温15~60分钟.10.0.1MPBS 洗三次,每次5分钟. 11.0.05M Tris CHCL 5~10分钟,此步可省略.12.DAB―H2O2 显色:用0.01%H2O2的DAB溶液,室温5~30分钟,随时镜检(DAB用时 新配)13.自来水洗净.14.用Mayer 苏木精或0.5%甲基绿,复染胞 核(可不染).15.常规脱水、透明、封固、镜检.结果:棕褐色反应产物代表抗原X的定位.

(四)免疫组化染色基本技术及注意事项1.实验计划① 根据课题的内容选用动物,选用配套的Ab. 如Ab―I鼠抗人的抗体,与其他种属间无 交叉,则 不能用其他动物,而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠,若PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠,否则不能连接成复合物.② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差 异,在贴片方面最好贴于同一张载片上,否 则无可比性. ③ 选用的试剂可靠,货源充足,随时可取.2.Ab稀释度 (如系购买的药盒有工作液和原液)(1)工作液:无须稀释(2)原液: ① 应参照其提供的工作液浓度进行预试验验.如:工作液浓度为1∶1000, 可选1∶500 1∶1000,1∶1500试验;

若: 1∶500有背景,1∶1000阳性反应稍 浅,可选1∶750进行试验. 原液的保存(―20℃)冻存――应选最佳稀 度冻存.③ 若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释 十倍,而后分装10μl/瓶→冻存(-20 ℃) 于 冰箱备用.④ 关于Ab保存应参照说明书.(3)Ab浓度的选择 Ab浓度不可太高或太低,因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行,若一方过剩则形成复合物小且少;

极过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性.――并非Ab浓度越高越好. 3.Ab滴片技术 ―― 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合.[注意] 滴抗体前需把切片上的水弄干,但不能 干片. 要领:甩净组织周围的水.4.PBS洗涤技术(1)洗涤的目的 ① 保证离子浓度和PH值. ② 减少非特异反应(平时Ab不可靠很纯) Ab滴片图示: (2)方法:洗三次,每次5分钟.5.Ab孵育技术(1)必须在湿盒内进行,以防抗体的蒸发和干片. (2)温度与时间 4℃:过液,16 37℃:1 h or 参考说明书6.光镜控制显色方法(1)室内操作:注意温度与时间的关系,室温 最宜5分钟.(2)染色稍浅亦可拿出,脱水,封片后颜色可 加深.

(五)对照组和染色结果的评价 免疫组化染色实验组与对照组结果分析表 从表上可以看出,只有6,7实验结果有意义.1~5均因对照组的结果已否定Ab的特异性or因IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义,必须重复实验or换用Ab. 除上述对照结果分析之外,还必须从以下几 个方面综合评价: 1.阳性染色特点① Ag定位,胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构 性.(非特异性~细胞与组织无区别)② 染色强度不同:颜色深浅不一(非特异性染 色 弥散性均匀)2.组织切片制作过程的影响① 固定不良―非特异性染色,显示不均.② 边缘干燥―非特异性染色(常见),加抗体 时勿干片.3.人工假象与特异性结果显示不在同一平面上. 阳性对照:用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色.对照切片呈阳性结果,标为阳性对照. 阴性对照: 用确证不含已知抗原的标本作对照,应呈 阴性结果,称阴性对照.其实这只是阴性 对照中的一种,阴性对照还应包括空白、 替代、吸收和抑制实验. 染色失败的几种原因:(1)所染的全部切片均为阴性结果,包括阳性 对照在内.全部(-)原因可能: ① 染色未完全严格按照操作步骤进行;