PDF《活细胞超灵敏结构光超高分辨率显微镜》

5 ] ;

以及基于结构光照明的结构光 照明显微镜[ 6,

8 ] .

1 超高分辨率显微镜主要分类 1.

1 单分子定位超高分辨率荧光显微镜 几纳米大小的单个荧光分子通过荧光显微镜成 像, 由于衍射极限, 在检测器平面上形成直径几百纳 米的光斑, 其荧光强度可以近似地用荧光分子中心 为山峰峰顶的二维高斯函数拟合.也就是说单个很

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8 中国科学基金2018年 小的光点经显微镜成像后放大成光斑, 所以也叫做 显微镜 的点扩散函数, 其大小与物镜的数值孔径有关. 荧光显微镜分辨率的定义是当两个相同亮度的 荧光分子相邻时, 仍然能够分辨出来是两个分子时 的最小距离.分辨率与显微镜的点扩散函数( 半高 宽) 大小有关, 极限在2

0 0n m 左右.单分子定位超 分辨率荧光显微镜的原则在于如果通过调制荧光分 子的特性, 每次光照射样本时只选择激发其中的一 部分稀疏分布的荧光分子.这些彼此之间的距离超 出了显微镜点扩散函数的荧光分子在成像之后, 形 成相当于许多个独立的点扩散函数大小的光斑, 对 每个光斑用二维高斯函数拟合, 可以定位出每个光 斑的中心位置, 定位精度可以达到二十纳米甚至几 纳米, 远远优于显微镜的衍射极限.在时间尺度上 重复这个过程, 最后定位样本中所有荧光分子, 这就 是单分子定位超高分辨率显微成像. 埃里克?贝齐格于1

9 9 5年推断如果荧光分子 可以开关就可以利用这个特性来打破分辨率的衍射 极限[ 9] , 由于特定的荧光激活打开的绿色荧光蛋白 P A G G F P的出现2

0 0 6年第一次真正实现这个原理 的超高分辨率成像, 命名为 P h o t o A c t i v a t e dL o c a l i G z a t i o nM i c r o s c o p y ( P A LM) [

2 ] .同年, 哈佛 大学的庄小威博士以及缅因州大学的 H e s s博士也提出类 似概念并加以实现, 分别命名为 S T o c h a s t i cO p t i c a l R e c o n s t r u c t i o n M i c r o s c o p y( S T O RM) [ 3] 以及f l u o G r e s c e n c eP h o t o A c t i v a t i o n L o c a l i z a t i o n M i c r o s c o p y ( f P A LM) [

4 ] .因此, P A LM / S T O RM 等方法的主要 原理是利用荧光分子的光激活/光转换特性, 通过弱 激光随机激发稀疏的光激活/光转换荧光分子发光, 观察并拟合确定它们的位置, 然后再漂白它们并激 发出来新的分子, 如此激发―定位―漂白―重新激 发的循环成千上万次后, 就可以得到所有分子的精 细位置信息了.由此可见, 单分子定位显微镜的基 本原理就是荧光分子的开关不断切换过程, 不管是 P A LM 使用的光转换荧光蛋白[ 2] ;

还是 S T O RM 使 用的c y

3 G c y 5荧光染料对[ 3] , 或者直接利用其染料的 闪烁特点. 同样是2

0 0 6年, 化学家 R o b i nM.H o c h s t r a s s G e r发现了一种荧光分子结合脂质导致的荧光开关过 程[

1 0 ] , 其基本原理是尼罗红( N i l eR e d) 染料游离于 水溶液的时候不会发光, 一旦和脂质结合便可以发 红光.利用这个特性, 根据染料与脂质结合和解离 的速度, 计算出所需荧光染料的浓度, 使用相应的浓 度的荧光染料来处理细胞, 保证在每次曝光时间内 一个点扩散函数大小范围内只有一个荧光分 子亮起, 这样连续拍几千张原始图像, 对每个亮起来的荧 光分子定位, 并把所有的定位结果综合起来, 也可以 得到一幅超分辨率图像[