PDF《活细胞超灵敏结构光超高分辨率显微镜》

1 0] , 这种方法被称为 P o i n t s A c c u m u l a t i o nf o r I m a g i n g i nN a n o s c a l e a n dT o p o g G r a p h y ( P A I NT) . 1.

2 受激辐射超高分辨率显微镜 斯特凡?黑尔博士于1

9 9 4年提出受激辐射超 高分辨 率显微镜(STED) 的原理[

5 ] , 但是也是到2000年才真正实现成像过程[

1 1 ] .它的基本原理是 给予处于激发态的荧光分子泵浦足够能量, 通过 受 激辐射 过程将它们强制回到不发荧光的基态或者 发出与荧光波长不同的光.强制荧光分子回到基态 的光就叫做淬灭光, 它与荧光蛋白发出光波长相同. 将激发光和淬灭光耦合在一起照明样本, 其中淬灭 光经过相位板后可以形成围绕激发光的环.这样虽 然激发光仍然激发点扩散函数范围内所有的荧光分 子, 但周围的荧光分子由于淬灭光的存在处于受激 辐射不发光的状态.只有在点扩散函数最中间的地 方, 由于淬灭光光强极弱或者为零, 荧光分子才会仍 然处于激发态上从而发出荧光.本质上, S T E D 可 以理解为在激发光照明样本的同时, 用另外一束擦 除光来缩小激发光的激发分子范围, 通过缩小激发 的点扩散函数来提高成像的分辨率. 1.

3 结构光超高分辨率显微镜

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0 0年, M a t sG u s t a f s s o n 博士提出通过结构光照明 来提高显微镜分辨率的概念[ 6] , 但他直到2008年才将三维结构光显微镜真正集大成优化到 可以在生物样本较好应用的程度[

1 2] . 理解结构光超高分辨率显微镜的前提是理解空 间结构变化程度与频域空间的频率高低之间 的对应.精细的空间结构对应于频域空间的高频信号, 因为显微镜的点扩散函数对应于频域空间的光学传 输函数, 因此显微镜只能传输在光学传输函数频率 内的信息.本质上来说, 显微镜就像是一个低通滤 波器, 将高频空间信息滤除, 成像结果分辨率的大小 取决于光学传输函数的大小. 普通的显微镜在照明荧光样本的时候, 一般会 使照明光在空间上均匀分布, 从而便于定量化荧光 强度.结构光超高分辨率成像的原理在于将均匀的 照明光变成具有特定空间结构的结构光( 包括明暗 相间的正弦波模式) , 在空间频域上对样本进 行调制, 将本来处于光学传输函数范围外的样本高频信 第4期 黄小帅等:活细胞超灵敏结构光超高分辨率显微镜

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9 息移动到光学传输函数范围内, 通过特定算法还原 出来高频信息.能够得到多少超出光学传输函数范 围外的高频信息取决于照明光结构的精细程度, 同 样受衍射极限的限制.因此, 线性结构光超高分辨 率显微镜最高能够将光学传输函数截止频率两倍内 的高频信号移入光学传输函数截止频率内, 也就是 实现两倍分辨率的提升. 通过饱和激发 耗竭或者应用光开关蛋白的方法, 还可以实现非线性激发结构光显微镜成像, 分辨 率可进一步提高到5 0n m 左右的成像分辨水平[

1 3 ] . 饱和吸收的方法原理为一个空间上正弦分布的激光 激发出来的荧光在激光照明强度比较弱的时候, 在 空间上是正弦分布的.随着激光照明强度进一步增 强, 正弦波峰值位置荧光分子发光开始趋近于饱和, 正弦分布的荧光开始趋近于矩形分布.这时候空间 频域上不仅仅叠加了照明光的周期, 还包含了照明 光周期的高频谐波分量.把所有的高阶项分别求解 出来之后, 像线性结构光照明显微镜的处理方式一 样, 把所有的高阶项放在其对应的位置, 再对所得到 的频域图像做傅里叶逆变换, 便可以得到一幅更高 分辨率的图像.因为饱和激发结构光照明显微镜的 频域含有无数个高阶项, 所以, 饱和激发结构光照明 显微镜没有理论分辨率极限.