PDF《中国实验动物学会》

五、 标准主要技术内容说明,确定标准主要内容(如技术指标、参数、公式、 性能要求、试验方法、检验规则等)的论据(包括试验、统计数据) 本标准由范围;

规范性引用文件;

缩略语;

生物安全措施;

酶联免疫吸附试 验(ELISA);

免疫荧光试验(IFA);

普通 RT-PCR;

实时荧光 RT-PCR;

序列测 定和附录共

10 章构成.现将《实验动物大鼠泰勒病毒检测方法》征求意见稿主 要技术内容确定说明如下:

1 本标准范围的确定 本标准规定适用于实验动物大鼠泰勒病毒的检测.

2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注明日期的引用文件,仅注 日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的 修改单)适用于本文件. GB

19489 实验室 生物安全通用要求

3 缩略语 为方便标准的使用,本标准规定了以下缩略语 CPE 细胞病变效应(cytopathic effect) Ct 值 荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(cycle threshold) ELISA 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay) IFA 免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay) PBS 磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline) PCR 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) RNA 核糖核酸(ribonucleic acid) RT-PCR 逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction) RTV 大鼠泰勒病毒(rat theilovirus) 实时荧光 RT-PCR 实时荧光逆转录-聚合酶链式反应(real-time RT-PCR)

4 生物安全措施 规定了实验操作及处理按照GB 19489的规定执行,由具备相关资质的工作 人员进行相应操作.

5 酶联免疫吸附试验(ELISA) 规定了 ELISA 检测方法的原理、试剂和材料、仪器和设备、操作步骤、结 果判定.本章内容主要依据国家标准《GB/T14926.50-2001 实验动物 酶联免疫 吸附试验》编写.

6 免疫荧光试验(IFA) 规定了 IFA 检测方法的原理、试剂和材料、仪器和设备、操作步骤、结果判 定.本章内容主要依据国家标准《GB/T14926.52-2001 实验动物 免疫荧光试验》 编写.

7 普通 RT-PCR 规定了普通 RT-PCR 检测方法的原理、 试剂和材料、 仪器和设备、 操作步骤、 结果判定.

8 实时荧光 RT-PCR 规定了实时荧光 RT-PCR 检测方法的原理、试剂和材料、仪器和设备、操作 步骤、结果判定.

9 序列测定 必要时,可取待检样本扩增出 的阳性PCR产物进行核酸序列测定,序列结 果与已公开发表的大鼠泰勒病毒特异性片段序列进行比对, 序列同源性在90%以上,可确诊待检样本大鼠泰勒病毒核酸阳性,否则判定大鼠泰勒病毒核酸阴性.

9、附录 A 本标准附录为规范性附录,给出了 PBS 配制方法.

六、主要试验(或验证)的分析

(一)实时荧光 RT-PCR

1 材料与方法 1.1 病毒、菌株、载体和临床样本 大鼠泰勒病毒 RTV-PSD32 毒株由本实验室分离保存,小鼠脑脊髓炎病毒 (TMEV,ATCC VR-995)、小鼠肝炎病毒(MHV,ATCC VR-246) 、大鼠冠状病 毒/涎泪腺炎病毒(RCV,ATCC VR-1410) 、仙台病毒(SV,ATCC VR-105) 、小 鼠肺炎病毒(PVM,ATCC VR-25) 、呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo-3,ATCC VR-232) 、 大鼠细小病毒 KRV 株(KRV, ATCC VR-235) 、 大鼠细小病毒 H-1 株(H-1, ATCC VR-356) 、小鼠细小病毒 MVM 株(MVM,ATCC VR-1346) 、鼠痘病毒(Ect, ATCC VR-1374) 、多瘤病毒(Poly,ATCC VR-252) 、小鼠腺病毒(Mad,ATCC VR-550) 、小鼠巨细胞病毒(MCMV,ATCC VR-1399) 、购自美国典型微生物菌 种保藏中心,小鼠出血热病毒(HV)抗原为浙江天元生物药业股份有限公司生 产的双价肾综合征出血热(汉滩型和汉城型)灭活疫苗,淋巴细胞性脉络丛脑膜 炎病毒(LCMV ) 核酸由中国食品药品检定研究院惠赠、MNV Guangzhou/K162/09/CHN 毒株由本实验室分离保存,BHK 细胞(ATCC CCL-10) 购自美国典型微生物菌种保藏中心.大肠杆菌 E.coli DH5α购自宝生物工程(大连) 有限公司 (Takara 公司) . 含T7 启动子的克隆载体 pGEM-T Easy 购自 Promega 公司, 临床样本包括: 来源于