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8 ] 和琼脂糖凝胶电泳鉴定SD和SmD基因片段.在24孔板中接种对数生长期的K562细胞, 分别用MOI为

10、

20、 50和l00的重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP及其 突变体进行感染,

24 h,

48 h 后在荧光显微镜下观察 EGFP的表达情况. 1.2.7 重组腺病毒在K562细胞中的表达与鉴定 分别 用Ad5F35-SD-EGFP、 Ad5F35-SmD-EGFP和空载腺病 毒Ad5F35-EGFP感染AD293细胞,

48 h后离心收集细 胞, 一部分进行RT-PCR逆转录成cDNA, 以此为模板 PCR扩增目的基因SD和SmD, 引物和条件同前;

一部 分细胞提取蛋白进行 SDS-PAGE, 电转移至 PVDF 膜上, 以抗 HA 单抗为一抗(

1 ∶1000 稀释), 羊抗鼠 IgG-HRP为二抗 (

1 ∶ 3000稀释) , ECL化学发光系统检 测目的蛋白表达. 1.2.8 MTT实验检测重组腺病毒对K562细胞增殖能力 的影响分别用MOI 为100 的Ad5F35-SD-EGFP, Ad5F35-SmD-EGFP 进行感染

96 孔培养板中的 K562 细胞 ( 2*104 /孔) , 并设置PBS对照组,

37 ℃、 5% CO2培 养箱中培养72 h后在每组的3个平行孔中加入四甲基 偶氮哇盐(MTT)0.5 mg/ml, 继续培养

4 h 后离心弃上 清, 加入200 μl DMSO, 振荡5 min, 用酶标仪在570 nm 处读取吸光度值(A值), 按以下公式计算细胞增殖抑制 率:细胞增殖抑制率=(1-实验组平均A值/对照组平均A 值)*100%. 1.2.9 细胞周期测定 胞周期测定实验分组同上, 用病 毒感染1*l06 K562细胞.24 h后收集细胞, PBS洗2次后, 70%乙醇中固定过夜, 上机前洗去乙醇.加入PCB溶 液室温低渗处理

30 min 后离心弃上清, 加入

50 g/ml RNase A消化30 min, 再加入终浓度为50 g/ml的PI染 液室温避光孵育25 min, 用FCM检测. 1.2.10 统计学方法 统计学方法采用SPSS15.0软件进 行数据分析, 数据以均数±标准差表示, 各组间差异采用 方差分析, P........