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0.05). Conclusion The recombinant adenovirus vector Ad5F35-SD-EGFP we constructed can significantly inhibit the proliferation of K562 cells in vitro. Key words: Bcr-Abl;

SH2;

DED;

recombinant adenovirus;

AD293 cellS 收稿日期: 2011-08-13 基金项目: 国家自然科学基金 (

30871102 ) Supported by National Natural Science Foundation of China (30871102). 作者简介: 史静, 硕士, E-mail: [email protected] 通讯作者: 冯文莉, 教授, 博士生导师,

电话: 023-68485938, E-mail: [email protected] DOI: CNKI:44-1627/R.20111025.1122.009 【网络出版时间】 2011-10-25 11:22:13 http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1627.R.20111025.1122.009.html 南方医科大学学报 (J South Med Univ) 2011;

31(11) ・ ・1806 慢性粒细胞白血病 ( CML ) 患者95%以上具有特异 性的费城(Philadelphia, Ph)染色体, 该染色体能够翻译 出具有强烈酪氨酸激酶活性的Bcr-Abl融合蛋白, 继而 激活PI3K、 Ras、 STAT5, Jak等信号转导通路, 导致细胞 恶性转化[

1 ] .在CML中, Bcr-Abl融合蛋白第177位的 酪氨酸位点磷酸化后 ( Y177-p ) , 能与 Grb2 ( Growth receptor bound protein

2 ) 的SH2 ( Src homology2 ) 结构 域特异性结合, 进而激活导致细胞恶性增殖的信号通 路, 如RAS-MAPK和PI3K-AKT[ 2-3 ] .在细胞膜死亡受 体介导的细胞凋亡途径中, 凋亡蛋白caspase8的激活是 细胞发生凋亡的关键一步, 而Fas相关的死亡结构域蛋 白(Fas-associated protein with death domain, FADD ) 通过其死亡效应结构域 ( death effector domain, DED ) 启动 caspase8 前体蛋白寡聚化是 caspase8 激活的关 键[ 4-5 ] . 在Grb2 蛋白的 SH2 域能与 Bcr-Abl 的Y177-p 特 异性结合、 FADD蛋白的DED域能募集caspase8前体 蛋白并使之寡聚化的分子基础上, 本课题拟构建 SH2-DED融合基因, 通过基因重组技术构建重组腺病 毒Ad5F35-SH2-DED及其突变体, 继而在bcr-abl阳性 的慢粒细胞中表达目的基因, 利用其SH2端能够竞争抑 制Grb2与Bcr-Abl结合、 DED端诱导细胞凋亡的特性, 达到抑制CML细胞增殖和诱导凋亡的双重目的.为进 一步研究SH2-EDE融合蛋白对慢粒的治疗机制和体内 效应奠定基础.

1 材料与方法 1.1 材料和试剂 1.1.1 质粒, 菌株, 细胞和生长条件 腺病毒穿梭质粒 pAdTrack-CMV, E.coil DH5α, BJ5183菌株, AD293细 胞和 K562 细胞株均为本室保存;

腺病毒骨架质粒 pAd5F35-EGFP由瑞典隆德大学生物医学中心惠赠, pGFP-FADD质粒由美国科罗拉多大学肿瘤研究中心 Andrew Thorburn教授惠赠.DH5α用LB培养基,

37 ℃ 振荡培养;

AD293细胞用含10%胎牛血清的DMEM培 养基, K562细胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培养基, 培养基中均含有100 U/ml青霉素、

100 μg/ml链霉素、

37 ℃、 5% CO2的培养箱中培养. 1.1.2 主要试剂及仪器 DNA marker, RT-PCR试剂盒, T4 DNA连接酶, DNA聚合酶, 蛋白酶K, 普通限制性 内切酶等均购自 TaKaRa;

限制性内切酶 Pme I、 Pac I 购自 New England BioLabs;

DNA 纯化试剂盒, 胶回 收试剂盒购自华舜公司;

质粒提取试剂盒购自OME- GA;

脂质体LipofectamineTM

2000 购自Invitrogen;

DMEM与胎牛血清购自GIBCO公司;

引物合成及测 序 (上海生工) . 1.2 实验方法 1.2.1 引物设计与合成 根据GENBank中人FADD中DED结构域的基因序列, 设计并合成DED的扩增引物: DED-P1: GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGG TTCTCCGTTCCTGGTGCTGCTGC,DED-P2:5'

CCC AAGCTTCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATG- GGTACCCAAGCTTCTAAGCGTAGTCTGG3'