PDF《?1806?》

, 方框内为Hind III酶切位点, 下划线为HA标签序列. 根据 GENBank 中人 GRB2 基因 ( NM_002086.4 ) SH2序列的CDS, 设计并合成SH2的扩增引物SH2-P1: 5'

CGGGGTACCGCCACCATGTGGTTTTTTGGCA AAATCCCCAG3'

, SH2-P2: 5'

ACCACCACCAGAAC- CACCACCACCTTCTATGTCCCGCAGGAATATCT G3'

(框内为KpnI酶切位点) .SH2-mt基因是在SH2蛋 白第86位精氨酸突变为赖氨酸 ( R86K ) 的核苷酸序列, 通过在突变位点设计重叠PCR引物扩增SH2-mt基因, 突变位点引物序列如下: R86KP1: 5'

CTCTCACTC TCTTTGATAAGAAAG3'

;

R86KP2:5'

CTTTCTTAT- CAAAGAGAGTGAGAG3'

( 下划线为突变位点 ) . 1.2.2 目的基因的克隆腺病毒穿梭载体的构建 以pGFP-FADD质粒为模板, 以DED-P1和DED-P2为引 物扩增 DED 片段 (

264 bp ) , 扩增条件为 (

98 ℃,

10 s;

56 ℃,

15 s;

72 ℃,

40 s)

30 个循环.以K562 细胞的 cDNA为模板, 以SH2-P1和SH2-P2为引物扩增SH2片段(310 bp), 反应条件如下:

98 ℃,

10 s;

55 ℃,

15 s;

72 ℃,

30 s, 共30个循环;

72 ℃延伸5 min.PCR产物经 凝胶电泳后纯化回收, 等摩尔的SH2和DED片段经拼 接反应后,以SH2-P1 和DED-P2 为引物,扩增SH2-DED融合基因 (

606 bp ) , 扩增条件同SH2.同理, 以SH2-P1和R86KP1为引物扩增含突变位点的SH2mt 上游片段, 以R86KP2和SH2-P2为引物扩增包含突变 位点的SH2mt下游片段, 拼接PCR扩增SH2mt基因全 长, 在通过二次拼接PCR, 扩增出SH2mt-DED基因. 将SH2-DED和SH2mt-DED基因片段分别经Kpn I 和Hind III双酶切后克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV- EGFP, 命名为pAdT-SD-EGFP 和pAdT-SmD-EGFP ( SD 为SH2-DED 的缩写, SmD 为SH2mt-DED 的缩 写).1.2.3 重组腺病毒质粒pAd5F35-SD-EGFP 和pAd5F35-SmD-EGFP的构建 腺病毒穿梭质粒pAdT- SD-EGFP 和pAdT-SmD-EGFP 经Pme I 酶切后进行 CIAP去磷酸化处理 (

50 ℃,

1 h ) , 转化pAd5F35-BJ5183 感受态, 在含卡那霉素 (

50 mg/ml ) 的LB平板上置37 ℃ 培养箱中培养18~24 h, 挑取单克隆菌落进行增菌, 最后 提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳.Pac I酶切鉴定电泳位 置高于骨架质粒Ad5F35-GFP的重组质粒.鉴定正确 史静,等.重组腺病毒 Ad5F35-SD-EGFP 的构建及其对 K562 细胞增殖的影响 第11期・・1807 的腺病毒载体分别命名为pAd5F35-SD-EGFP 和pAd5F35-SmD-EGFP. 1.2.4 重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP 和Ad5F35-SmD- EGFP的包装和扩增 在6孔板中接种对数生长期的 AD293细胞, 将4 μg pAd5F35-SD-EGFP经Pac I酶切 后用乙醇沉淀法纯化后测定浓度( μg ),与LipofectamineTM 2000脂质体 ( μl ) 按照1 ∶ 3的比例, 感染 AD293细胞 [

6 ] .每隔3 d在荧光显微镜下观察绿色荧光 蛋白的表达情况.当观察到细胞病变 ( cytopathic effect, CPE ) 效应时, 收集细胞和上清, 离心弃上清, 重复 冷冻-融化-涡旋振荡 4次, 收集病毒, 制备第一代的病 毒液, 命名为重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP.在T75培 养瓶中接种7*106 个AD293细胞, 常规扩增腺病毒[

7 ] , 收集病毒悬液, 分装后置-80 ℃保存.重组腺病毒 Ad5F35-SmD-EGFP的包装和扩增步骤同上. 1.2.5 重组腺病毒的滴度测定 将AD293细胞接种96 孔板, 每孔1*105 /ml,

24 h后, 每孔分别加入10 μl不同 稀释倍数 ( 10-4 , 10-5 , 10-6 , 10-7 , 10-8 , 10-9 , 10-10 , 10-11 , 10-12 , 10-13 ) 的重组病毒 Ad5F35-SD-EGFP 和Ad5F35-SmD- EGFP进行感染,

24 h后在倒置荧光显微镜下进行荧光 计数并测定滴度, 病毒滴度 ( pfu/ml ) =(每孔荧光平均数* 10)/稀释度. 1.2.6 重组腺病毒的鉴定 以SH2-P1, DED-P2为引物, 以蛋白酶K裂解的重组腺病毒DNA为模板进行PCR 反应 [