PDF《禽网状 内皮组织增殖病病毒LTR序列的启动子功能》

0 .

2 】 . R E V 基 因组两 端的长 末端重 复序列 ( L T R)非常保 守 ,同源性 在9

4 %以上I 引 .通过 P C R 方法, 特 异性地 扩增 R E V L T R序列常被用 作检 测R E V存在 的方法 曲J.牛泡沫病 毒(Bovinefoamyvirus,BFV)、 劳斯肉瘤病 毒(Roussarcomavirus , R S V) 和 人免疫缺 陷病 毒(Huma n i mmu n o d e f i c i e n c y v i r us ,H I V)的LTR已被证实具有体外真核启动子活性,并且能够 在E . c o l i @起始基因表达I 卜圳,但未见关于禽网状 内 皮组 织增 殖病病 毒(Reticuendotheliosisvirus,REV) L

1 1 R 作 为启 动子方 面 的研 究报 道.由于R E V在 感染 宿主后,能够 以c DN A的形式整合进宿主细胞的基 收稿日期;

2

0 0

3 ―

1 1 -

2 1 ,修回日期:2

0 0

4 .

0 l 一05基金项 目:江苏省教育厅高校自然科学研究计划项I ~ (

0 1 K J B

2 3

0 0

0 t ) 通讯作者:赵文明(

1 9

6 9 - ) , 男, 硕士. 江苏泰州人, 主要从事动物分子生物学研究. C o r r e s p o n d i n g a u t h o r , T e l :

0 5

1 4 -

7 9

7 1

8 3

9 : E - r e a l : w m z h a o @y z u . e d u . a

1 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国病毒学第l9卷 因组,并且R E V和马立克氏病病毒 ( MD v)共感染 或共 培养 时,L T R 基 因可整 合进MDV 基 因组 中ll,并且随着培养代次 的增多, 含L T R的MDV所 占的比 重会增加u ,提示L T R可能会作为启动子,加强某 些与病毒MDV复制有关基因的表达 . 为了验证R EV L T R在体 外 的启 动活 性 ,本研 究 构建 了以 R E V L T R作为启动子的表达质粒,通过检测GF P 基 因和 R E V g p

9 0 基因的表达,验证了R E V L T R 基因的体 外 启动 活性 .

1 材料 与方 法1.1鸡胚和毒株

9 ―

1 1日龄 S P F鸡胚购 自南京药械厂 ;

R E V HA 毒株,T G1 宿主菌 由本实验室保存 .

1 .

2 分子生物学试剂 p UC1

8 , P C R K i t , T

4 D NA 连 接酶 , X― g a l , I P T G 等 均购 于大连 宝生物 工程有 限 公司 ;

F r r C 购于Sigma公司: 脂质体 (

1 i p f e c t a m i n e ) 购于 Gi B c o B R L 公司;

质粒纯化试剂盒购于 Qi a g e n公司 :鼠抗重组 p GE X― e n v ― g p

9 0血清 由吉荣制备 ,本实验室保存. l _

3 病毒 的扩增 按照常规方法制备鸡胚成纤维细胞 ( C E F ) , 待 细胞近

8 0 %铺满 培养瓶底 时,接种 液氮 中冻存 的HA株REV,并维持

7 d后收获 .

1 .

4 病毒 基因组 D NA的提取 参照 分子克隆 中介绍的方法进行『 l ,简略 步骤如下 :加适量消化缓冲液 ( 含蛋 白酶 K)于收 获的细胞液中,5

0 ℃消化过夜;

苯酚氯仿抽提后, 用乙醇沉淀 D NA,最后将沉淀溶解在

5 0 p L T E中 备用 .

1 .

5 P C R循环试验共设计 了 4对 引物,分别用于扩增 R E V L T R基因,B GH p o l y A 终止序列,GF P基因以及 R E V g p

8 5基因,引物中含有用于克隆的酶切位点. ( 引物 由上海生工生物工程有 限公司合成) .各片段 的引物序 列如下: F L T a

5 一AAAGGAATT CAA TGTGG - GAGGGAGC '

TC 一3RL T a :

5 一GTTGGAGCT CCAAATG'

I ~GT A TCGAAGT A 一3RB G H

5 一CC TAA F G F P :

5 一ACGC ~ T ACCAAGAATGGACTGT CTCACC一3lFP5一AAAGTCGACTGGTGGAGGACA T AGC一3Fspgo5一ATAGT CGACAGT GAACCGT CAGATCC一3Rg p

9 0 .

5 一TF ACT GCAGACI TGT ACAGCTCGT CC一3PCR按常规方法进行 ,反应体系为

5 0 p L,其中10*P CR Bu f fe r5 p L,d NTP(

2 .

5 mmo l / Le a c h)

4 L , 引物 (