PDF《应用双质粒共表达体系提高融合蛋白 GGH 在毕赤酵母》

1 (Glucagon-like peptide-1, GLP-1) 是由肠道 L 细胞合成和分泌的一个由

30 个 氨基酸组成的具有促进胰岛素分泌功能的多肽,体 内外研究显示 GLP-1 能增强葡萄糖依赖性的胰岛素 分泌,减少食物的摄取,减慢胃的排空,以及抑制 胰高血糖素的分泌、刺激胰 β 细胞增殖,促进胰岛 再生,又能抑制胰 β 细胞的凋亡,是现有糖尿病药 物无可比拟的[1-4] .但是,由于 GLP-1 在体内易被 二肽酰基肽酶Ⅳ (DPPⅣ) 降解和肾脏清除导致半 衰期很短,限制了其临床应用[5] .为克服该缺点, 本实验室前期通过重叠 PCR 将两个 GLP-1 突变串联 体分子与一个人血清白蛋白 HSA 分子融合 (ggh), 并实现了其在巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris 中的 表达[6] . pPIC9K 和pPICZαB 同属于巴斯德毕赤酵母分 泌型表达载体,可以通过同源重组的方式分别在毕 赤酵母基因组 HIS4 位点与 AOX1 位点进行整合, 实现在同一宿主菌中的共表达,从而提高目标蛋白 在毕赤酵母中的基因剂量,在一定范围内可以提高 目标蛋白的表达量.Williams 等将pPIC9K 和pPICZαA 质粒同时整合到毕赤酵母 GS115 中,建立 双质粒共表达体系,从而提高了明胶在毕赤酵母 GS115 中的表达量,由原来的 54.4 mg/L 提高至 80.2 mg/L[7] . 本实验室前期将 GGH 基因克隆到毕赤酵母分 泌型表达质粒 pPIC9K,构建了重组菌 GS115/F2, 摇瓶培养

80 h 其目的蛋白表达量达到

328 mg/L[8] . 本研究通过构建 pPIC9K 和pPICZαB 双质粒共表达 体系, 进一步提高了融合蛋白 GGH 在毕赤酵母中的 表达量,为该药物分子的规模化制备奠定了基础.

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌体和载体 大肠杆菌 E. coli JM109 由本实验室保存;

质粒 pPIC9K-ggh、pMD19-T-gapdh 和毕赤酵母表达菌 株GS115/F2 由本实验室构建并保存;

pPICZαB 购自Invitrogen 公司;

pMD19-T Simple Vector 为TaKaRa 公司产品. 1.1.2 主要试剂 各种限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、DNA 和蛋白 Marker 等购自 TaKaRa 公司, 质粒抽提试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒、PCR 产物 纯化试剂盒均购自上海捷瑞生物有限公司,酵母氮 基、Zeocin、HRP-DAB 底物显色液等均为上海生工 产品,GLP-1 和HSA 单克隆抗体等购自优宁维公 司,引物由上海捷瑞生物有限公司合成,其余试剂 均购自国药集团化学试剂有限公司. 1.2 方法 1.2.1 酵母表达载体 pPICZαB-ggh 的构建 设计合成分别带有 KpnⅠ和NotⅠ两种酶切位 点的 GGH 引物,引物 P

1、P2 序列见表

1 (下划线 所示为酶切位点).以pPIC9K-ggh 为模板,P

1、 P2 为引物,扩增出 5′端和 3′端分别带有 KpnⅠ和NotⅠ两种酶切位点的 ggh 基因,然后和 pMD19-T Simple Vector 相连转化至 E. coli JM109,用含有

100 μg/mL Amp 的LB 平板筛选阳性克隆验证, 并抽提质粒用 KpnⅠ和NotⅠ双酶切后连接至毕 赤酵母表达载 体pPICZαB 中,重组表 达载体 pPICZαB-ggh 转化至 E. coli JM109, 用含有

25 μg/mL 王慧等: 应用双质粒共表达体系提高融合蛋白 GGH 在毕赤酵母 GS115 中的表达量

985 Journals.im.ac.cn 表1本研究中所用引物 Table

1 Primers used in this study Primer name Primer sequence (5′?3′) Size (bp) P1 GTGCGGTACCGAGAAAAGACACGGT GAAGGTACTT P2 GATTGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGG CAGCTT

1 937 P3 CGAGGAGCAGGACTGACA P4 TGGACCGCGCTGATGAAC

159 P5 GGACTGGAGAGGTGGTAGAAC P6 AGCAGCCTTGATAACAGACTTG

213 P7 AATGCGCTATTAGTTCGTTAC P8 TGTCACTTACTGGCGTTTTC