PDF《应用双质粒共表达体系提高融合蛋白 GGH 在毕赤酵母》

201 The underline showed site of enzyme digestion. Zeocin 的LB 平板筛选阳性克隆,并进行 PCR 和双 酶切鉴定. 1.2.2 重组表达质粒的线性化和电转化酵母细胞 取5~10 μg 鉴定和测序正确的 pPICZαB-ggh 重组表达质粒,用PmeⅠ单酶切使之线性化,琼 脂糖凝胶电泳回收 5.6 kb 片段,?20 ℃保存备用. 参考相关文献制备毕赤酵母 GS115/F2 感受态细胞[9] , 分别取

80 μL 和5μL 的线性化的重组表达质粒 pPICZαB-ggh 混合,用Bio-Rad 电转仪于参数 1.5 kV、25 μF、200 ?、时间常数

5 ms 进行电转化, 立即加入 l mL

1 mol/L 冰浴山梨醇,在30 ℃条件下 孵育

2 h.取200 μL 涂布于含有

1 000 μg/mL Zeocin 的MD 平板上,30 ℃培养 2~3 d 至出现转化子. 1.2.3 免疫斑点法筛选高表达菌株 将0.45 μm 的醋酸纤维素薄膜平置于长有菌落 的含有

1 000 μg/mL Zeocin 的MD 平板上,用涂布 棒轻压使醋酸纤维素薄膜完全湿润并赶尽气泡,使 所有菌落转移到醋酸纤维素薄膜上, 并在 BMMY 平 板上置同样大小的 0.22 μm 的硝酸纤维素薄膜,赶 出气泡,将醋酸纤维素薄膜菌落面向上置于硝酸纤 维素薄膜上,30 ℃培养

80 h,将上层醋酸纤维素薄 膜转移至 MD 平板上,4 ℃保存.将下层硝酸纤维 素薄膜取出,5%脱脂奶封闭

2 h 或4℃过夜,用TBST (含有 0.05%吐温-20 的TBS) 洗膜

5 min,重复3次,用兔抗人血清白蛋白多抗

37 ℃孵育

2 h, 用TBST 洗膜

5 min,重复

3 次,再用二抗结合,

37 ℃孵育

2 h,用TBST 洗膜

5 min,重复

3 次,加 入新鲜配置的 DAB 显色液,染色

5 min 后用 TBST 清洗,挑选出染色颜色较深的菌落进行摇瓶培养和 诱导. 1.2.4 诱导表达及表达产物分析 挑取膜上颜色由深到浅的单菌落接种于

10 mL 的YPD 培养基,培养

24 h,5%接种量转接到装有

60 mL 含3%甘油的 BMGY 培养基的

500 mL 三角瓶 中,初始 OD600 为1,30 ℃、120 r/min 振荡培养过 夜,24 h 后离心收集菌体,用20 mL 含有 3%甲醇 的BMMY 培养基重悬菌体后诱导表达,每隔

24 小 时补加甲醇至终浓度为 3%,甲醇诱导

80 h 后OD600 约为 200,10

000 r/min 离心

10 min,收集上 清,用尿微量白蛋白试剂盒测发酵上清液中的目的 蛋白含量[6] , 发酵液离心后取上清等体积进行SDS-PAGE 分析. 1.2.5 重组毕赤酵母基因组的提取和 PCR 鉴定阳性 克隆 提取高产菌 GS115/F3 和出发菌株 GS115/F2 的基 因组 DNA,加入 RNase A 消除 RNA 的干扰.以pPICZαB 质粒上的抗性基因,即Zeocin 基因为扩增 目的片段设计引物 P

3、P4,序列见表 1,对提取的 酵母基因组 DNA 进行 PCR 扩增验证. 1.2.6 Q-PCR 鉴定高产菌的目的基因拷贝数 以三磷酸甘油醛脱氢酶基因 (gapdh) 为内源参 照基因.根据引物设计软件 Primer

5 设计基因 gapdh (P

5、P6)、ggh (P

7、P8) 片段引物 (表1),进行PCR 扩增,回收基因片段并与 pMD19-T 质粒相 连,建立单拷贝的重组质粒,即pMD19-T-gapdh 质 粒和 pMD19-T-ggh 质粒,转化到大肠杆菌 JM109 中,验证并提取重组质粒,通过梯度稀释,从而建 立了 gapdh 基因和 ggh 基因的循环数 (Ct 值) 与起始 模板数的相关标准曲线.Q-PCR 的条件是:94 ℃预 变性

4 min;

94 ℃变性

30 s,55 ℃退火

45 s,72 ℃

986 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech July 25,

2011 Vol.27 No.7 Journals.im.ac.cn 延伸

30 s,读板,40 次循环;

72 ℃终延伸

5 min;

65 ℃到94 ℃绘制熔解度曲线,每0.5 ℃读板