PDF《应用双质粒共表达体系提高融合蛋白 GGH 在毕赤酵母》

1 次,

1 次1s;

16 ℃保温至结束.Q-PCR 的体系是:模板0.5 μL,引物各 0.2 μL,SYBR 12.5 μL,ddH2O 11.6 μL. 以gapdh 为参照基因,检测待测样品中的 ggh 基因表达水平的差异,以原始菌株 GS115/F2 为校准 样本,以高产菌株 GS115/F3 为待测样本,比较待测 样本相对校准样本的表达差异.利用 2?Ct 法对其 分析. 1.2.7 Western blotting 鉴定融合蛋白的表达 将原始出发菌株 GS115/F2 和高产菌株 GS115/F3 的发酵液离心取上清,

200 V 电压下进行 SDS-PAGE 电泳,

100 V 电压下转膜

60 min 至硝酸纤维素膜上, 5%脱脂奶粉

4 ℃封闭过夜,TBST 洗膜

3 次,分别 加入鼠抗人血清白蛋白单抗和鼠抗人 GLP-1 单抗结 合 (抗体均以 1∶1

000 稀释),37 ℃孵育

2 h,去除 抗体,TBST 洗膜

3 次.再加入辣根过氧化物酶标记 的抗鼠的二抗 (1∶1

000 稀释),37 ℃下孵育

2 h, 去除二抗,TBST 洗膜

3 次之后,加DAB 显色.

2 结果 2.1 表达载体 pPICZαB-ggh 的构建及鉴定 构建了含有 ggh 基因的毕赤酵母重组表达质粒 pPICZαB-ggh,构建流程如图

1 所示,然后对其进行 PCR 及KpnⅠ/NotⅠ双酶切鉴定 (图略).重组的 pPICZαB-ggh 经PCR 及双酶切都可以得到大小为

2 000 bp 左右的 DNA 片段, 测序结果显示 DNA 序列 无突变,表明重组表达载体 pPICZαB-ggh 构建成功. 2.2 免疫学方法筛选高产菌株 将线性化的重组质粒 pPICZαB-ggh 电转化毕赤 酵母 GS115/F2 感受态细胞,3........