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9 N o .1 h .

1 99d P C R和生物素探针对 H F R S V的检测和分型的探讨 唐家琪 李越 希, /李先 富 潘秀珍 郭 恒彬 张云--――――,一r― ――――一V饵r 京军区军事医学研兜所 , 南京

2 1 ~

0 9

2 ) R 修≥ 提要 分析比较肾综台征出血热病毒( H F R S V )

7 5 / l

1 8 株和 I t

2 : 株的按苷馥序列 , 根 据引物设计原则 及检测分型的目的 , 设计并台唬了

3 对弓 f 物.

1 对弓 f 物取于两毒株间的高嗣源区段, 作为共同引物和 外引材 ・ 另两对弓 f 物取于两毒株阿的低同源区段. 分别作为野 鼠型引物 、 家鼠型引物和内弓 f 物. 建立 了DNA聚合酶链反应( P Ot ) 和l~cstPCR方法 , 并用 l ~ c s t P C R台成 了两种型特异的 生物素探针. P C R检测

7 B / l

1 3 、 、 陈、 I t

2 、 R n

5 个 毒株, 用外弓 f 物时均扩增出

1 条约

3 O

0 b p 的条带 ;

用内弓 f 物的野 鼠型引物时 , 除如株之外 , 其余

4 株均扩增出

1 条约

7 0 b p的条带.斑点杂交试验证实了P C R检测 尔 干姬 鼠型 、 小 鼠型 6个血清型[ 】 ] . 我国的 HF R S V称为流行性出血热病毒 ( H H F V) , 分 为野鼠型 、 家鼠型两个血清型 .其野 鼠型 代表 毒株有 A . 株等 , 与朝鲜 出血热代表 毒株

7 6 / i

1 8株等 同届姬 鼠型・其家 鼠型代表毒株有

2 株等 , 与 日本 S R ― I I 株同届 大 鼠型. H F R S V的正确分 型,对流行病 学调 查,疫苗研制 、 临床治疗 均有重 要意 义.由于二者抗 原关 系密切 , 交叉反应严重 , 用免疫学 方法分 型很 困难 [

2 ] .许多学者对单克 隆抗体分 型寄予希 望,应用单 克隆抗体 的RIP和 We s t . e r a- b l o t 可 以证实两型 H F R S V G 和NP蛋 白分 子量存在差异口 ] . 由于抗 原漂移及毒株 问基 因 重组造成的表 型差异 , 有 些分 型结果可能含糊不清 .H F R S V为负链 R N A病毒 , 由L、M、 s

3 个基因片段组成嘲, z s / ns 、 s R ― l

1 、 R ∞ 等毒株的 M、 S片段序列 已研究清楚 口.本文在详细分 析 比较上述

3 株IfFRSV基因编码特点和 核苷酸序 列的基础上 , 设计 、 合成 了共 同引物 、 型特异 引物,用RNA逆 转录 及DNA聚合酶链 反应 ( P C R) 对HFRSV进行检测及分型 . 材料和方法 l 引袖的设计与合成 用计算机基因组程序处理分析

7 6 /

1 1

8 、 I t

2 : 、 S R -

1 1

3 十代表株的核苷酸序列. 根据 引 物设计原则和检测分型的 目的, ―对共同引物( 外引物) 选于 M 片段 , 其左侧引物同讶 c 于76/118株 c D N A

3 2

3 9 ―

3 2

5 6 段,为TAA A TG G GA I ~ I T C TG A G -

3 ~ I 其右侧引物互补于

7 6 /

1 1

8 株cDNA3535--3

5 2

2 段,为―TGTT A GA T AT r AG ^ G 一3,,

扩增段全长为

2 9

8 . 型特异引物( 内引物) 选于 M片段扩增序列当中, 其左僵 I 引 物同源于

3 4

5 1 - -3

4 6

6 段,右侧引物互补于

3 5

2 1 - -3

5 0

3 段,扩增片段全长为

7 1 b p . 其巾野鼠型引物根据

7 6 /

1 1

8 株序列设计 , 左储引物为

5 r - G C T从A'

i r eT G TG A C T .

3 , . 右侧 引物为

5 f - T A TA C TG G A A T AT A -

3 ;

家鼠型 引物根据 P m株序列设计 , 左侧号 『 物为 一AATO C TA C CC A TT A A T .

3 I . 右侧引物为

5 '

- C C AG G T - -T A AG T T ,本文于

1 9

3 3 年 3月