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2 I 混匀后作聚丙烯酰胺凝胶 电泳 .胶浓度为

1 2 , 电诛缓冲液为 l *T 髓.1

0 0 V, 电辣 血 后取下胶块 , 用EB染色 l ( ] m i n , 在紫外灯一 F 观察扩增条带的有无 , 并根据扩增条带与标准参比 D N A的位置关系估算其 b p 数. B 生物素探针的制备 以酶切回收的

7 6 /

1 1

8 株和 R

2 : 株M片段部分 c D N A为模板 . 以Bio-l'

l―dI玎.P(s培咖)取代 d '

I T P , 按上述 p c R方法和车系统确定的参数进行扩增 , 分别利备家鼠型和野 鼠型生物索探针. D 斑点杂 交试验

1 取扩增产物

1 于礅量离心管 , 加INN a O H1

6 o . i .

0 .

5 t o o l / LE D T A

2 0 v .

1 , 加水补至

4 0

0 ~

1 , 幌匀使 D N A 变性.9.2硝基纤维紊膜( S e t ~ c a e r a n d S e h a e U ) 用2X.S~液授温 , 用点样皿在负压抽滤条件下将扩增产物点于膜 上.80 C烘烤2h.9.3将曦装于杂交袋中, 按1∞锄量加入预杂交液(

5 0 甲酰胺 ,

5 XS . ~ .

5 XD e a h a r d t '

8 液,0.5mrnl新鲜切变的蛙鱼精于 D N A ,

5 O m m o t / L礴酸钠缓冲蔽 p } I

0 ,

5 r e t o o l / LE D T A ) , 封口,

4 2 ℃顼杂交

2 b .

9 .

4 倾去预杂交液 , 加入杂交液 ( 蚰n 蚰 新鲜变性的生物索标记 D N A撵针 .

5 甲酰胺 .

5 *s s c , l * b ~ r d t '

日藏.2/L礴 酸盐 p H6 .

5 , 仉z , , r dm~ 新鲜 切变 的鲑鱼精 于DNA ) , 分 别于

3 8 ℃、 O ℃、

4 2 ℃杂文

2 4 h .

9 .

5 倾去 杂交 液.用洗 液(o.1XS S C ,

0 .

1 S D S ) 室温 振荡 洗涤

1 5 mi n X3 ,

6 5 ℃ 洗涤20rain*3 , 每次用 洗液不 少于

2 5

0 m1 . 维普资讯 http://www.cqvip.com 第1期唐家琪等 : P C R和生物素探针对 H F R S V的检测和分型的探讨

2 7

9 .

6 将 膜装 入另―杂交袋 . 加3Bs^4.0ml ,4

2 '

C封闭1h.9-7倒出封 闭液 , 按 生物 寨 试剂盘 ( 军事 医学科 学院 二所 ) 使用说 明先 后 加人 亲台 寨 一硷性 辞酸 酶.洗涤、显色、终止反 应.结果lPCR量佳条件的探 讨.以回收 的76/118株M片段部分 c D N A为模板 , 进行PCR, 共循 环40次变性条件为

9 d ℃ l m i n , 延仲条件为

7 0 '

C m i n , 比较 不同复性条件 的扩增结果可见 : 复性 温度高于

3 8 C时,电泳未 能见条带 } 复性温 度为

3 8 C时,电泳可见 一条约

3 0

0 b p的条带 ( 眉外 引物) 或约

7 0 b p的条 带(用内引........