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1 5H收到 , 6胃28日謦目 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国病毒学第9卷 GT o

3 '

.上述引 物用 B 州Ⅻ381A合成 仪合成 .

2 毒辕和菌株 } Ⅱ 删的株、R株系中国预防医学科学院病毒所杭长寿研究员惠赠.上述毒株均在 V e t o - F 4细胞中增殖 . 其 中的 A . 株、 R ≈ 株经克隆化纯化后分别传2

5 代和

1 0 代. 古76/118株M片段 c D N A的 质粒 P 腿,丑(转化在 m l 细菌内) 系军事医学科学院八所夏东翔博士惠赠 . 含株M 片段 c D N A的质粒P U C n ( 转化在 J M1

0 3 细菌内) 系杭长寿研究员惠赠. , 质粒的扩增和提取 取苗种斜面保存物少许接种 L B液体培养基 .

3 7 C 振荡培养过夜.将活化菌接

1 接 种量转种于三角烧瓶中培养 . 每瓶含 L B 培养基

2 O

0 m l ( 含氮苄青霉索

1 0

0 ~ m

1 ) .

3 7 C继续振荡培养

1 4 b . 收集 培养液, 离心取湿苗. 用碴变性法抽提质粒 . 再超建离心分离出超螺旋质粒. -2

0 C 保存. 目的 片段的酶切和回收 根据计算机检索 . 在M 片段 c D I , '

A上选择合适的酶切位点. 用P宕【1酶将插 在质粒 P 豫;

上的

7 6 /

1 1

8 株M片段 『 A切下 . 回收后再用 E c o R V酶切.回收约

1 .

0 k b 的cDNA片段 .用BamH l 和EcoRI双酶切 , 将插在质粒 P 【 上的 R ≈ 株 M片段末端约 B O O b p 的cDt,TA切下. 用低融点琼脂糖分剐 回收 上述两 个 目的 片段 c

1 ) NA, 溶于'

rE( p H i .

0 ) 液中.一2

0 ℃保存 , 作 为探讨 P c R条件和制 备生物 索探 针 的模 板.s}Ⅱ删RNA的提取 取组织培养标本加等体积

4 0 的PEGG000.4℃作用 l h .

1 0

4 3

0 0 r / r n ~ n 离心

2 0 n '

d n . 弃 上清 .沉淀用异硫氰酸胍/ 酚/ 氯仿( A O P C ) 处理 , 即每份标率溶于 I ) S 溶液 ( J .

0 ~ / L ) 异硫氰酸胍 o .

5 s c o z y l ~ .

2 5 r e t oo l / L拧椽酸钠

7 .

4 .

0 .

1 n '

~/ L2 - 琉基 乙醇)

5 中再依次加入

2 m ( d / L N a A C ( p H

4 . o )

1 0

0 ) d . 酚( 水 平衡) s o ) d . 氯仿/ 异戊酵(

4 9 I

1 )

1 0 o ) . d .倒置轻摇混匀 , 振荡

1 0 s , 冰浴

1 5 r a i n ,

4 C

1 0

0 0

0 r / r a i n 离心

1 5 m i n . 沉淀 用75%呤乙醇洗 涤.真空抽 干,最后用DEPC(FlukaOa~nie.AG) 处理 过的H: O

4 0 ~

1 溶解 R NA,

2 0 C 保 存供逆 转 录用 , 操作用器械 和试 荆均 需用 ⅨK 处理 的HzO荡洗 .

1 逆转晕反应和 P C R扩增 所用试;

f ! 【 、 教量离心管、 热循环扩增仪为 P E公司产品.首先向

0 .

5 m l 微量离心 管 内依次 加入25mm o l / L

4 ) d ,1

0 *B u f f e r

2 l L

1 . 灭菌 去离 子水

1 , l O m mo l / L . d A T P 、 d C T '

p 、 d G T P 、 d WF P各,RNa 吕eInfloW.totl p l (

1 u ) , A MV逆 转录酶 l l A (

2 .

5 u ) .

0 .

1 5 t m

3 o l / L左侧 弓渤

1 . 模板2.总量为

2 1 . 混 匀后 将离心管 放热循环仪 内39 C逆 转录25mi r , , 再作99 C5mi n .5 C

5 n处理.向原 离 心管 加上述Ms C l ~ . B u f f 时舢 ,

0 6

3 . , 左、右恻引物各 a d , T a q D N A聚合酶

0 .

5 ~ i (

2 .

5 u ) , 总量为 l O

1 .混匀后加灭苗石腊油

4 放热循环仅内进行扩增.通过 比较不同变性条件 、 复性条件、 延伸条件的扩增结果 . 确立本系统的扩增参 数.T扩增结果的检 取扩增产物

6 I l

1 , 与漠酚兰 电泳上样液