PDF《免疫组化（Immunohistochemistry）实验指南》

②除去防碍抗原-抗体结合的类脂,使抗原抗体结合物易于 获得良好的染色结果;

③固定的标本易于保存.固定剂的选择一般用 4%多聚甲醛,但睾丸组织、眼组织可能要选 用Bouin'

s 液或 mDF 液效果较好. 2)脱水、石蜡包埋和制片:脱水用梯度乙醇(由低到高)充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋 利.否则,容易裂片和脱片等. 3)脱蜡和水化:这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应.脱蜡可以先

60 度20min,然后立 即二甲苯 1-3 分别 10min (这个时间是由二甲苯新鲜程度和室温等综合决定的) , 但当天制好的切片一般先

60 度3-4h. 水化用梯度乙醇(由高到低) .若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全,而产生非特异性背景着色. 4)抗原修复:由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中,发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用,从而 失去抗原性;

通过抗原修复,使得细胞内抗原决定族重新暴露,提高抗原检测率.常用的修复方法从强到弱一般分 为三种,高压修复、微波修复、胰酶修复.修复液也分为若干种(具体的可以查阅相关资料,大量的:中性的、高pH 的等) .一般用微波修复中火 6min*4 次,效果不错.注意微波修复后自然冷却 30min 左右(只要你觉得修复液 的温度达室温即可) . 5)细胞通透:目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应.一般用 Triton X-

100、蛋白酶 k 等通透液.如Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内,故在细胞 免疫组化时尤为推荐使用,这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合.在免疫组织化学(>

10um 厚切片) 和免 疫细胞化学中一般用 Triton X-100 作为细胞通透剂,在膜上打孔.同时也是一种去污剂,一般在 PBS 中加入后终浓 度是 0.05%即可,而前者终浓度是 0.5%-1%.石蜡切片 4um 左右可以不通透,因为细胞已经被切开了. 6)灭活内源性过氧化物酶和生物素:在传统的 ABC 法和 SP 法中,免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶和 生物素的干扰, 必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活. 灭活内源性 POD 一般用 3%过氧化氢灭活, 时间 10min 左右, 而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间,一般 10~30min;

用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或 PBS 可能好在保护抗 原和固定组织作用,过氧化氢孵育时间过长易引起脱片;

现用现配,配好后

4 度避光保存.不过,现在已有 第二 代即用型免疫组化试剂盒 避免内源性生物素的干扰,推荐使用.

4 上海纽普生物科技有限公司 公司网站:http://www.novoprolabs.com 7)血清封闭:组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合,造成后续结果的假阳性;

封闭血清一般是和二 抗同一来源的,血清中动物自身的抗体,预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合;

也可以用小牛血清、BSA、 羊血清等,但不能与一抗来源一致.一般室温 10-30min.但也要防止封闭过度 8)一抗和二抗浓度和孵育时间:一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要,包括孵育时间、温度和抗体浓度.一抗 孵育温度有几种:4 度、室温、37 度,其中

4 度效果最佳;

孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般

37 度1-2h,

4 度过夜(从冰箱拿出后

37 度复温 45min) .具体条件还要摸索.二抗孵育条件:二抗一般室温或