PDF《免疫组化（Immunohistochemistry）实验指南》

37 度30min-1h, 具体时间需要摸索,而浓度一般有工作液,若是浓缩液还要摸索浓度.但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵 育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间.建议一抗反应在

4 度最佳,反应温和,但时间最好超过 16~24h. 9)抗体稀释液:其实许多实验室抗体稀释液就用一般 PBS 即可,但专用的抗体稀释液中除 PBS 成份外,还加了叠 氮化钠防腐剂、BSA 稳定剂等组份,对抗体的多次回收利用较好. . 10)切片清洗(浸洗、冲洗和漂洗) :为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色,所以适当地加强清洗 (延长时间和增多次数) 尤为重要, 我一般在一抗孵育前的清洗是 3min*3 次, 而一抗孵育后的清洗均为

5 次*5min. 注意:①单独冲洗,防止交叉反应造成污染.②温柔冲洗,防止切片的脱落,一般用浸洗方式;

③冲洗的时间要足 够,才能彻底洗去结合的物质.④PBS 的PH 和离子强度的使用和要求(建议 PH 7.4-7.6,浓度是 0.01M;

中性及弱 碱性条件有利于免疫复合物的形成,而酸性条件则有利于分解;

低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强 度则有利于分解) . 11)DAB 显色:背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由 DAB 孵育条件决定.DAB 显色时间不是固定的,主要由显 微镜下控制显色时间,到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗;

DAB 显色时间很短(如几秒或几十秒) 就出现很深的棕褐色,这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长,需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵 育时间;

此外,若很短时间就出现背景很深,还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全,需要延长封闭时间;

DAB 显色时间很长(如超过十几分钟)才出现阳性染色,一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短(最好一抗

4 度过夜) ;

另一方面就是封闭时间过长. 12)复染:目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位,经常用苏木素复染(胞核染料) .注意苏木素 复染时间要看当时的室温、 溶液的新旧、 目标抗原的定位等情况, 一般数秒-数分钟, 胞浆蛋白可以适当时间长一点, 而胞核蛋白则要短.不过这个如果染色不理想可以补救的.方法是:染色深则分化时间稍长些即可;

染色浅则再置 于苏木素中染色即可.片子复染完后流水振洗,然后置于盐酸酒精中数秒(一定动作要快)后拿出流水振洗,再放 入氨水中返蓝即可. 13)封片:为了长期保存, 我们一般用中性树胶等封片, 避免产生气泡, 方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液, 然后一手拿住盖片某一拐角, 而另一手拿对面的那个拐角, 接近封片液近端的拐角先降低, 直至接触到液体时为止;

当发现液体接触面在不断弥散时,则可以缓慢降低另一拐角,这样一般不会产生气泡.

5 上海纽普生物科技有限公司 公司网站:http://www.novoprolabs.com 免疫荧光方法中主要步骤 1)冰冻切片制备:建议用新鲜组织,否则组织细胞内部结构破坏,易使抗原弥散.选用干净锋利的刀片、组织一 定要冷冻适度等,防止裂片和脱片. 2)组织切片固定:切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定 5-10min,尤其要较长时间保存的白片,一定要及 时固定和适当保存. 3)血清封闭:为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前先用血清(与二抗来源一致)封闭,减 弱背景着色.血清封闭的时间是可以调整的,一般 10-30min. 4)一抗孵育条件:在免疫组化反应中最重要,包括孵育时间和抗体浓度.一抗孵育温度有几种:4 度、室温、37 度,其中