PDF《免疫组化（Immunohistochemistry）实验指南》

4 度效果最佳;

孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般

37 度1-2h,4 度过夜(从冰箱拿出后

37 度复 温45min) .具体条件还要摸索. 5)二抗孵育条件:一般室温或

37 度30min-1h,具体时间需要摸索,而浓度一般有工作液,若是浓缩液还要摸索浓 度, 一定要避光反应. 但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下, 然后去摸索一抗浓度和孵育时间. 最后,荧光素标记的二抗随着保存时间的延长,可能会有大量的游离荧光素残留,需要注意配制时小包装和并进行 适当的离心. 6)复染:目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位.一般常用 DAPI 复染. 7)封片:为了长期保存,我们一般用缓冲甘油等封片,此外还有专门的抗荧光萃灭封片液.避免产生气泡,方法 是直接在载玻片组织上滴一滴封片液,然后一手拿住盖片某一拐角,而另一手拿对面的那个拐角,接近封片液近端 的拐角先降低,直至接触到液体时为止;

当发现液体接触面在不断弥散时,则可以缓慢降低另一拐角,这样一般不 会产生气泡. 8)切片清洗:为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色,所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数) 尤为重要,一般在一抗孵育前的清洗是 3min*3 次,而一抗孵育后的清洗均为

5 次*5min. 注意: (1)单独冲洗,防止交叉反应造成污染. (2)温柔冲洗,防止切片的脱落.我喜欢用浸洗方式;

(3)冲洗的时间要足够,才能彻底洗去结合的物质. (4)PBS 的PH 和离子强度的使用和要求(建议 PH 在7.4-7.6,浓度是 0.01M;

中性及弱碱性条件有利于免疫复合 物的形成,而酸性条件则有利于分解;

低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度则有利于分解) 9)拍照:有条件的话最好立即拍照,若不能及时拍照,也要封好片和用指甲油封固,保持避光和湿度.使用荧光 显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作,不要随意改变程序;

应在暗室中进行检查;

防止紫外线 对眼睛的损害,在调整光源时应戴上防护眼镜;

检查时间每次以 1~2h 为宜,超过 90min,超高压汞灯发光强度逐 渐下降,荧光减弱;

标本受紫外线照射 3~5min 后,荧光也明显减弱或褪色;

激发光长时间的照射,会发生荧光的 衰减和淬灭现象;

所以最多不得超过 2~3h;

荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检查,以节省时间,保护光源. 天热时,应加电扇散热降温,新换灯泡应从开始就记录使用时间.灯熄灭后欲再启用时,........