PDF《第7卷第 1期》

b ) | P o l i o v i r u

8 VP1 t n d

2 A g … ;

c ) | P D l i o v i r u B t o '

a i g Ⅲ w i t b

0 u t

2 A;

d ) : Po i i o v i r u B VPl g … .

三、重组|壳毒 的 克豫 菇选上述所收病 毒谳以l0_. 、 l

0 稀释 爱 按种 单层I~t3TK一 细胞 . 加含Rudr 一(25}Ig/m1 )E a g l e液(3啦小 牛血 靖),

3 7 C4

8 h ,弃此培养潦,清洗细胞 后排入含X- g a l (1

5 g . / m1 )的琼 脂培养基(含

5 嘧小 牛血 清), 置37 C,2

4 h内司 见兰斑出现 ,拢斑扩增 . 同法重复,得 到纯化克隆 ,此克隆毒种在 B u d r(

2 5 v . g / m1)培养液中传二代 .

四、重组| 南毒 的D N^点豢变重蛆病毒扩增,收 集惑槊细胞 , 以蔗糖 梯度离心洼 纯化,以 T E 悬浮,I E确证l B 】 . 加蛋白酶 K至2

5 m g / ml ,S DS

0 .

0 5啦3

7 C8 h,以酚、 氯仿 抽提 , 乙醇 沉淀 ,T E 溶解,按

0 .

2 g /

2 / *

1 量点硝酸纤维膜,8

0 ℃2 h 变性;

探 针取 自pSV2

0 2 - B (含去 除2A基 因的 P VI 型Mahoney株金基因),B a mHl 酶 切所 得1.8kb片段(台YP1和 部分 YP 2区)¨P 标记,点杂 交方 法同资料l・l.五重担病毒PV抗 原鼬荧光捡剽重龃癌 毒接种细雎 ( 细脏 剥 娄后 述), 待病 变后,离心收集细胞,P Bs 洗后稿片 , 用标记费光素的抗P Y I型 特异 性 单克 隆 抗体

3 7 o C反应lh,洗 片染色,荧 光镜检浏l】.

六、重担藏毒曲动 物免痤按(4]法纯化病 毒 ,最 终群释为10PFU/ ml ,皮 内按

0 . 2ml / 点接隶兔馥部.共 五个点,两 周后同法 加强~次,一 周后再以静 脉 取血 备栓.

七、免疫 动物PV抗体 柱测使用微量中 和法t 】 ,以P V I型Ma h o ~ e y 抹 为参考 栋.

八、重担|壳毒 对不同细 胞株曲适应性取滴度为1UPFU/ ml的重组病毒以1ml 川、力瓶接种己成 单层的1,$3TK,He p - 2, Wi s h(A 羊膜), KME一17(F28),VⅢ ( P1

6 0 )等细 咆加合3和 小牛血清的Ea g l e 液 ,置3

7 C. 待病变完全,计 时并 测 其病 毒滴度.维普资讯 http://www.cqvip.com 第 1期 篝 奇耪等 行简藏 质蛊 { A蛋l^巫组 病毒l I l 的功 能研究

一、质粒 构建及 重组体病毒 的克隆 _ 圈2重组病毒 DNA的点 建交结果 F i g D0t b1 0t o f r e c o m bl n ant v i … e

5 D N A

4 5 经晦仞鉴定 , 得到pR一

1 } p R~

2 } p R

3 ;

p R一4重汛质粒 .经体内重.克隆筛选,最终选出R一

1 }R一2;

R一3jR一

4 阿个重组病毒株 .

二、惹汛 病毒均DNA 点杂交交结果 见困2, 四个重组病毒DNA 均与 P VI型探针 呈特 异性 阳 性反应, 表 明四个重组体均 台PV基 因.

三、重 组病毒PV抗原的荧 光检 测见图3, 感染 细胞荧光着染比例 和强度以R一1和R一

3 较强,R一2和R一4较弱.囤3四株重 组病 毒感染 H e p 一2细胞免疫 荧光捡 铡结果 Fi g .

3 Th e I F … un 0r t be He p

2 c e

1 I i nf e c t e d wi L h

4 日trifre~ombi na 口t vi ~ t t s

四、重 组病毒 免疫家兔所 致的PV 抗体滴 度 见表

1 , R一1和R一3在相同条件下得到较R一2和R一4高的 抗体滴 度. 五 、重组病毒 对不 同细 胞的适应 性 见表 2,其中, 对P V、VV敏感 的KMB 一

17、V e r o 细胞 均已无C P E,在lz

13、人羊膜 Wi s h 、 He p 一 2细胞上病变 时间有差 异, 但病毒滴度无显著差 异 (资料 未表 明)病变 细胞 皆经 荧光证实 已表达P V抗原. 维普资讯 http://www.cqvip.com

4 6 中国病毒学第7卷 裹1 t组嘉 所嚣导产 生的抗 体滴度 T b