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嚣'

PcR扩增 与扩'

- 产物电 泳分 析 扩增 反应 体积为

5 0 p

1 . 内含

1 . ~P C R缓冲{ 茁. 一对 P C R扩增 弓』物各150rig.样本

1 ~ ,

2 .

5 U D NA聚台 酶反应条件为

9 3 ℃变性

1 分钟 ,

5 5 C 退火

1 分钟,

7 2 C 硅帅1分钟 . 共进行

3 5十循环. 反应结柬后取

1 5 ~2 叫在6丙烯酰胺中电诛 . 澳化乙键染色后观察结果. s 碡I 酶切质粒 M1

3 r ~ p [

9 . 接Marct~kO的肯迭旧. 在线性 Ml

3 m p l

9 的3端各加 卜 一个 d T Ⅱ'

, 觏戚 T _ V ∞ .抽提 纯化 后,与经 电泳分离 、 纯化 的PCR产物 进 行连接 过夜,趺口转 化至 感 受态大 肠 杆菌

3 M1 O l ,

3 7 ℃过 夜培 养 .捷取 阳性自斑 , 抽提 和制 备 单链 D NA. D N A的序列分析采用通用引物 , 【 '

] d C T P ( S

0 0

0 0/ m m d/ L ) 标记和 船∞ w酶聚台延仲反应 .延仲终止 液 分别 为:A―Mi x (

4 .

1 v . m o l / Ld A T P. I .

7 p m o l / L d C T P.

8 2 p m o l / Ld G TP '

8 洲,L,30w~ol/LddAT~){C--№ (

6 2 .

5 V mo , / L d A T P , I . ? r * r n o l / L d c '

r P,

6 2 .

5 帅LdGT'

P,62.5.I|/L椰 .

1 5 p mo l / L d d C T P ) I G- -Mi x (

8 2 a mo l / L d A T P ,

1 .

7 m

0 I / L d C T P.

4 . I p r n o l / L d G TP .

8 2 r m mZ / L d T T P.

9 md/ L d d G T P ) I T - -Mi x (

8 2

4 m~/ Ld A T P.

1 . / L d C T P .

8 轧m o l / L d Gl ~ P.

4 .

1 l '

- n

0 l / L . I

5 / L d d l TP ) . 反应液

9 0 ℃变性3rrdn后 , 取I一于8襄丙烯 酰胺/ (

8 m ~/ L ) 尿素- f ・ 电泳 ,

1 8

0 0状3.5小时 . 将胶 阉定 后、吹干 . 医卜x 光片.于暗 台c I l 曝】 匕2 d小时 . 结果1PeR扩增法检测 NP C中EBVBamH I E z片段的部分 映失 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国病毒学第j0卷 首先.我们采用 引物对 A S E / z

2 R( 见图 】与表 】 ) , 体 外扩增 B

9 5 - -g 、 R a j d 和21饲低分化 型NPC组织 中EBVD N A的BamH[EZ片段 内部分序列. 该j物对在标准株 B

9 5 ―

8 E B V中相距

3 .

9 4 k b , 因片段太长 , 末见扩增产 物. 因RajiEBV属 来源于非洲 B u r k i t t s 淋 巴瘤细胞株 , 已证 实 该病毒 在BmnHI E Z区域内缺失

2 . ・

9 9 k b长的核酸 序列m, 经PCR法扩 增反应后 , 可预期 产生

9 5

0 b p扩增 产物 ,

2 1 倒NPCD N A的PCR扩增 结果提示 , 至少

1 1 例胄类 似大小的扩增 片段 . 为 了改 善PCR反应 的特异性和证 实顶 期的扩增 片段 , 我 们用 P C R产物 内部的一 对f物ASE2/SZ4 ( B

9 5 ― 8E B V中相距

3 .

6 9 k b ) 和第一次 P C R产物 (

1 /

1 0 '

稀释 ) 为模 板,进行第二移 ( P C R扩增 反应结果 提示 ,

1 l例NPC和 R a j i E B V均有预期的

7 0

0 b p扩增产物 , 表明 N P C中EBV的 B a mH [ E Z缺 失与 R a j i E B V类似( 见图

2 )

2 B Z L F I 基 因外显子一 i序列的 P C R扩增和序 列分析 在BZLF]基因 外显子一 1序列二^ 嘲合成了一对引物 z1 R/ z

2 ( 图1,表1),二者相距

4 4

5 b p . B

9 5 ― 8E B V 的序列 内有二 个. Hi n d Ⅺ内切酶 位点 . 我们将检测到 的阳性 P C R产韧 , 进行 Hi n dI f f 酶切电泳 分析 , 发现6饲 中有 2饲 出现 内切酶 位点 的改 变.N P C1 5为一例 B a mHI E Z片段

2 .

9 9 k b ~- 失的病 人,酶切 结果 显示,预期 的189bp.171bp和

8 5 b p片段 中,仅有

1 8

9 b p