PDF《产品信息和操作指南》

24 小时后,把-80℃保存的冻存管转移到液氮中. 8. 将细胞在液氮罐中冻存位置记录在实验室的液氮设备管理单 上.

5 细胞复苏程序 1. R10培养基和R0培养基需要在4o C热平衡, 无血清培养基需要37 ℃热平衡.50mL、15mL离心管需要4℃热平衡.水浴锅要预先 调到37℃. 2. 用镊子将细胞冻存管从液氮中取出.如果有液氮渗漏到冻存管 中,要稍微拧开管盖,让气化的液氮逃逸. 警告:据报道,有些冻存管在解冻时会发生爆炸,为了消除这种 危险,建议实验中只使用牢固的聚乙烯冻存管用于液氮保存. 3. 用镊子夹住冻存管,浸入37℃水浴锅内.轻轻的晃动冻存管, 注意管内冻存细胞的融化情况.当管内的冰核还有黄豆大小的 时候,取出来,转移到超净工作台内.用酒精棉擦拭管口,然 后将冻存管插于碎冰上. 注意:这一步对细胞存活率至关重要.既要尽快融化,以减少融 化过程对细胞的损害;

又要尽可能减少细胞在较高温度停留的 时间,以减少DMSO对细胞的毒害.切不可将冻存管放在水浴 锅内不管. 4. (冰上操作) 打开冻存管管盖, 逐滴加入1mL R10培养基(4℃). 轻柔的将冻存管内的细胞悬液(约2mL)吸取出来,转移到一 个预冷的15mL离心管内.逐滴加入3mL R10培养基 (4℃),边 加边轻摇混匀,滴加完之后盖上管盖,轻轻地上下颠倒混匀. 5. 继续缓慢补加R10培养基 (4℃)至14mL,拧上盖子,轻轻地颠 倒混匀. 6. 4℃,250g离心10 分钟.小心地吸出上清,要求上清液尽可能

6 吸走,同时又不触及管底沉淀的细胞.然后用手指轻弹离心管 管底,将细胞团分散. 注意:吸出上清比倒出上清更彻底,有助于减少DMSO的残留;

手指轻弹离心管可以很轻柔的将细胞团分散,不要用枪去吹 吸,否则对细胞有伤害. 7. 加入14mL R0培养基 (4℃,拧上盖子,颠倒混匀.说明:改用 R0培养基洗涤是为了将细胞过度到无血清培养基中,减少血清 对ELISPOT检测的干扰. 8. 室温250g离心10分钟,弃上清.加入1mL无血清培养基,混合 均匀.(从这一步开始,不再要求低温.) 9. (优化步骤,可以略过)如果细胞有成团现象,这是由于死细 胞释放出来的DNA缠绕所致. 可以加入0.1mL DNase(1mg/mL), 37℃孵育10分钟. 10.取50μL细胞悬液, 台盼蓝活细胞计数, 计算存活率 (viability) . 说明:存活率=活细胞数/细胞总数*100%.在台盼蓝存在的情 况下,活细胞呈无色,晶莹透亮,死细胞呈蓝色,暗淡无光. 11.(优化步骤,可以略过)让细胞休息过夜.具体做法是,松开 离心管的盖子,倾斜置于含5% CO2 的细胞培养箱,37℃孵育 过夜.次日,加入30mL不含血清的1640洗涤一次,再用无血清 培养基重悬.再次做台盼蓝活细胞计数. 12.根据计数结果,补加无血清培养基至所需要的细胞浓度,进行 ELISPOT检测.

7 注意事项: 细胞冻存 影响细胞冻存质量的关键在于低温(4℃)操作和缓慢增加细 胞溶液环境中的DMSO浓度.在滴加达优? 2*冻存液前后一定要在 冰上操作,不让装有细胞的离心管、冻存管离开冰水.滴加达优? 2*冻存液时一定要缓慢,控制在每3秒1滴(1mL约22滴,大约一 分钟滴加完毕).液滴在从离心管管口滴落到管底时,会有一个 自然的冲击力,另外滴入的2*冻存液密度较大,能够保证将滴入 的液滴与管内的溶液混合起来,因此不需要额外的混合.如果不 放心,可以轻轻摇动离心管,切不可用力过猛.DMSO浸入细胞 后,细胞膜变得非常脆弱,容易破裂. 在细胞冷冻降温中,类似于 Mr. Frosty 的含异丙醇的细胞 冻存盒能够提供接近于每分钟1℃的降温速度,从而保护细胞,减 少来自细胞内冰核的伤害.每使用5次之后,细胞冻存盒内的异丙 醇就应该更换,否则异丙醇的含水量会越来越高,细胞冻存盒的 降温速度也会改变.降温速度对细胞的存活率有重要影响,应该 严格控制不确定因素的干扰,建立标准化的实验操作. 细胞复苏 影响细胞复苏质量的关键在于低温(4℃)和缓慢降低细胞溶 液环境中的DMSO浓度.在将解冻的细胞悬液从冻存管转移到离 心管时,一定要在冰上操作.滴加最初1mL(在冻存管中)和3mL (在离心管中)R10培养基时一定要缓慢,控制在每秒1滴(1mL 约22滴,在30秒左右滴加完毕).由于R10培养基的密度比细胞冻 存液的密度低,所以在滴加的时候要注意混合均匀.在将细胞悬 液转移到15mL离心管之后,本操作手册规定了两次颠倒混合(一 次是在离心管中滴加完3mL培养基后,二次是在补加满14mL培养