PDF《DNA 合成原理概述》

-羟基过量保证了偶联的高效率. 4. 第四步――盖帽(Capping) ,为了防止未反应的与 CPG 相连的 5'

羟基在随后的循环中 被延长,需要在偶联反应充分进行之后使之封闭,常用乙酰化来封闭此羟基.临用前混 合乙酸酐和 N-甲基咪唑等形成一活性很强的乙酰化试剂,与少量未参与偶联反应的 5'

羟基形成酯键. 由于须封闭的羟基少且乙酰化试剂活性高和充分过量, 此步反应速度很 快,几秒钟即足够.太长的盖帽时间有在非预期位置发生乙酰化反应的可能,且增加乙 酸酐与痕量水形成酸攻击新生成的亚磷酯键的危险性. 5. 第五步――氧化(Oxidation) ,偶联反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键(磷为三价) 与CPG 上的寡核苷酸链相连,此亚磷酯键不稳定,易被酸、碱水解,因此需将此处三 价磷氧化为五价的磷.常用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液.此步反应速度亦很快.应注 意最后一个循环时,氧化步骤不可省略.此外亦可用其他氧化剂来完成氧化,从而得到 各种符合实验需要的寡核苷酸. 6. 循环上述一至五步,寡核苷酸链延伸至所需长度时即可完成.

3 DNA 合成基本原理 合成后处理 1. 切割: 将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来. 常用新鲜的浓氨水来裂解 CPG 上连接化合物与初始核苷间的酯键.断裂下来的寡核苷酸带有自由的 3'

羟基. 2. 脱保护基: 须在此步前选好后续的纯化方法. 一般用新鲜的浓氨水处理较长时间以脱掉 腈乙基、苯甲酰基、异丙基,用三氟乙酸脱 5'

-DMT. 3. 纯化:根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法.常用的纯化方法有:C18 柱、OPC 柱、PAGE 和HPLC. 4. 定量:根据寡核苷酸在 260nm 处的紫外吸收来定量. 5. 储存: 通常一次合成提供的寡核苷酸的量会比所需要的量大得多, 所以会涉及到寡核甘 酸的储存问题.一般来说,这不成为问题,因为寡核甘酸的稳定性很好.需要注意的是 避免紫外线等剧烈的物理环境,避免反复冻融,-20℃可稳定保存一年以上. DNA 合成粗产物中的短片段 DNA 自动合成仪采用固相亚磷酰胺三酯法合成. 现代最先进的 DNA 自动合成仪其单核 苷酸的连接率高达 99%,也就是说,寡核苷酸中一个碱基与下一个碱基的化学反应(偶联)

4 效率达 99%. 虽然化学反应中 99%的效率是非常高的,但在检查粗制寡核苷酸中杂质的成分时,应 考虑无效偶联率.如果有效偶联率是 99%,那么无效偶联率就是 1%. 下面以一条

10 个碱基长的寡核苷酸为例: 5'

-AGC TAG CTA G-3'

虽然碱基计数从5'

端开始,寡核苷酸的合成却从3'

端开始.第10个碱基(-G)固定在固 相CPG支持物上,碱基9和碱基10连接(-A到-G)的效率为99%,只剩下1%的碱基10未和 碱基9连接.在自动合成循环中,给这1%的未反应碱基10带上乙酰化的'

帽子'

,使之不再 参与以后的偶联反应,即所谓的盖帽步骤(Capping step) .如果偶联反应就此终止了,则 寡核苷酸粗产物中将会有如下组成: AG 99% G 1% 当与下一个碱基t连接后,粗反应混合物中组成为: TAG 98% AG 1% G 1% 依次类推,与碱基c连接后,粗反应混合物组成则是: CTAG 97% TAG 1% AG 1% G 1% 忽略影响合成过程的其它因素(空间阻碍、试剂污染以及微小的计算误差) ,到第10个 碱基末端时粗反应混合物组成为: AGC TAG CTA G 91% GCT AGC TAG 1% CTA GCT AG 1% TAG CTA G 1% AGC TAG 1% GCT AG 1% CTA G 1% TAG 1% AG 1% G 1%