PDF《分子生物学常用实验技术》

(2) 具有多种常用的限制性内切酶的单切点;

(3)能插入较大的外源 DNA 片段;

(4)具有容易操作的检 测表型. 常用的质粒载体大小一般在 1kb 至10kb 之间, 如PBR

322、 PUC 系列、 PGEM 系列和 pBluescript (简称 pBS)等. 从细菌中分离质粒 DNA 的方法都包括

3 个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;

收集和裂解细胞;

分离 和纯化质粒 DNA.采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100 可使细胞膜 裂解.经溶菌酶和 SDS 或Triton X-100 处理后,细菌染色体 DNA 会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于 细菌染色体 DNA 比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段.当用 强热或酸、碱处理时,细菌的线性染色体 DNA 变性,而共价闭合环状 DNA(Covalently closed circular DNA,简称 cccDNA)的两条链不会相互分开,当外界条件恢复正常时,线状染色体 DNA 片段难以复 性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒 DNA 双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋 分子,并以溶解状态存在于液相中. 在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在.在提取质粒过程中,除了超螺旋 DNA 外,还会产生 其它形式的质粒 DNA. 如果质粒 DNA 两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链 的张力,形成松驰型的环状分子,称开环 DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA);

如果质粒 DNA 的两 条链在同一处断裂,则形成线状 DNA(Linear DNA).当提取的质粒 DNA 电泳时,同一质粒 DNA 其超螺 旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快.

第二节 材料、设备及试剂

一、材料 含pBS 的E. coli DH5α或JM 系列菌株,1.5ml 塑料离心管(又称 eppendorf 管),离心管架.

二、设备 微量取液器(20μl,200μl,1000μl), 台式高速离心机,恒温振荡摇床, 高压蒸汽消毒器(灭菌 锅), 涡旋振荡器, 电泳仪,琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等.

三、试剂

1、 LB 液体培养基(Luria-Bertani) : 称取蛋白胨(Tryptone)10 g, 酵母提取物(Yeast extract)

5 g, NaCl

10 g,溶于 800ml 去离子水中,用NaOH 调pH 至7.5, 加去离子水至总体积

1 升,高压下蒸气灭 菌20 分钟.

2、LB 固体培养基:液体培养基中每升加 12g 琼脂粉,高压灭菌.

3、 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液:配成 50mg/ml 水溶液, -20℃保存备用.

4、 溶菌酶溶液: 用10mmol/L Tris・Cl(pH8.0)溶液配制成 10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml) 保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃.

5、 3mol/l NaAc (pH5.2): 50ml 水中溶解 40.81g NaAc・3H2 O,用冰醋酸调 pH 至5.2, 加水定 容至 100ml, 分装后高压灭菌,储存于 4℃冰箱.

6、 溶液Ⅰ:50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0), 10mmol/L EDTA (pH8.0). 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶 100ml,高压灭菌

15 分钟,储存于 4℃冰箱.

7、溶液Ⅱ:0.2 mol/L NaOH (临用前用 10mol/L NaOH 母液稀释),1% SDS.

8、溶液Ⅲ:5 mol/L KAc 60ml,冰醋酸 11.5ml, H2O 28.5ml,定容至 100ml, 并高压灭菌. 溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L.

9、 RNA 酶A母液: 将RNA 酶A溶于 10mmol/L Tris・ Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成 10mg/ml 的溶液,于100℃加热

15 分钟,使混有的 DNA 酶失活.冷却后用 1.5ml eppendorf 管分装成小份保存 于-20℃.

10、饱和酚:市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致 RNA 和DNA 的交联,应在 160℃用冷凝管进行重蒸. 重蒸酚加入 0.1%的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的 0.5mol/L Tris・Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris・Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其 pH 值达到 7.6 以上,因为酸性条件下 DNA 会分配于有机相.