PDF《分子生物学常用实验技术》

11、 氯仿:按氯仿:异戊醇=24:1 体积比加入异戊醇.氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相 的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫. 按体积/体积=1:1 混合上述饱和酚与氯仿即 得酚/氯仿(1:1).酚和氯仿均有很强的腐蚀性,操作时应戴手套.

12、 TE 缓冲液:10 mmo/L Tris・Cl (pH8.0),1 mmol/L EDTA (pH8.0).高压灭菌后储存于

4 ℃冰箱中.

13、STET:0.1 mol/L NaCl,10mmol/L Tris・Cl(pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0), 5% Triton X-100.

14、STE:0.1mol/L NaCl,10mmol/L Tris・Cl(pH8.0),1mmol/L EDTA (pH8.0).

15、 电泳所用试剂:(1) TBE 缓冲液 (5*):称取 Tris 54g,硼酸 27.5g,并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml,定溶至 1000ml. (2)上样缓冲液 (6*):0.25% 溴酚蓝,40% (w/v) 蔗糖水溶液.

第三节 操作步骤

一、 细菌的培养和收集 将含有质粒 pBS 的DH5α菌种接种在 LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时. 用无菌牙签挑取单菌落接种到 5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约

12 小时至对 数生长后期.

二、 质粒 DNA 少量快速提取 质粒 DNA 小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒 DNA 十分有用.这些方法共 同特点是简便、快速,能同时处理大量试样,所得 DNA 有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需 要.

(一) 、煮沸法

1、将1.5ml 培养液倒入 eppendorf 管中,4℃下12000g离心

30 秒.

2、弃上清,将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽.

3、将菌体沉淀悬浮于 120ml STET 溶液中, 涡旋混匀.

4、加入 10ml 新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡

3 秒钟.

5、将eppendorf 管放入沸水浴中,50 秒后立即取出.

6、用微量离心机 4℃下12000g 离心

10 分钟.

7、用无菌牙签从 eppendorf 管中去除细菌碎片.

8、取20ml 进行电泳检查. [注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒 DNA. 2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好.有时不同溶菌酶也能溶 菌. 3. 提取的质粒 DNA 中会含有 RNA,但RNA 并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及 连接反应等.

(二) 、 碱法

1、取1.5ml 培养液倒入 1.5ml eppendorf 管中,4℃下12000g 离心

30 秒.

2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽.

3、菌体沉淀重悬浮于 100μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置 5-10 分钟.

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口,快速温和颠倒 eppendorf 管数次,以混匀内容物(千万 不要振荡),冰浴

5 分钟.

5、 加入 150μl 预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口, 并倒置离心管, 温和振荡

10 秒,使沉淀混匀,冰浴中 5-10 分钟,4℃下12000g 离心 5-10 分钟.

6、上清液移入干净 eppendorf 管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g 离心

5 分钟.

7、将水相移入干净 eppendorf 管中,加入

2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中

20 分钟,然后 4℃下12000g 离心

10 分钟.

8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入 1ml 70%乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g 离心 5-10 分钟.

9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥

10 分钟或室温干燥.

10、将沉淀溶于 20μl TE 缓冲液(pH8.0,含20μg /ml RNaseA)中,储于-20℃冰箱中. [注意] 1. 提取过程应尽量保持低温. 2. 提取质粒 DNA 过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋 白尽量除干净需多次抽提. 3. 沉淀 DNA 通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使 DNA 沉淀完全. 沉........