PDF《产品信息》

6 RT-qPCR 实验方案 开始前请阅读本手册的重要提示部分(第5页) . 第一链 cDNA 合成 第一链 cDNA 合成反应可以以单个反应进行,而对于不同的 RNA 模板,也可以进行一 系列的平行反应.因此,反应混合液既可以通过将各组分溶液单独混合,也可以将 RT 反应 中除了 RNA 模板外的所有组分制成预混液. 解冻后,轻轻涡旋并短暂离心试剂盒所有组分.冰上放置. 1. 在冰上,将以下试剂按标明的顺序加入到无菌的、无RNase 的反应管中. 5*反应混合液

4 μl Maxima Enzyme Mix

2 μl RNA 模板

1 pg-5 μg 无核酸酶的水 to

20 μl 总体积

20 μl 2. 轻轻混匀并离心. 3. 25℃孵育

10 分钟,之后再 50℃孵育

15 分钟. 注:若RNA 模板量大于

1 μg,则延长反应时间至

30 分钟.若RNA 模板富含 GC 或含有大量的二级 结构,可将反应温度提高至 65℃. 4. 85℃加热

5 分钟以终止反应. 该反转录反应产物能够直接用于 qPCR, 或者在-20℃条件下存放一周. 如需长时间贮存, 推荐贮存于-70℃.另外应避免 cDNA 的反复冻融. qPCR 第一链 cDNA 合成的产物能够直接用于 qPCR. 加入的合成的 cDNA 第一链产物体积不 应超过 PCR 反应总体积的 1/10.通常情况下,在25 μl 体系的 qPCR 反应中加入

2 μl 合成的 cDNA 第一链作为模板. Maxima 第一链 cDNA 合成试剂盒适于和 Maxima qPCR master mixes (#K

0221、#K

0231、#K

0241、#K

0251、#K0261)搭配使用. 对照反应 实验中应利用如下负对照来确认第一链 cDNA 合成的结果. Reverse transcriptase minus(RT-)负对照:RT-PCR 和RT-qPCR 中应利用此负对照来 检验 RNA 样本中基因组 DNA 的污染情况.此负对照 RT-反应含有除 Maxima Enzyme Mix 以外的所有组分. 无模板负对照(NTC) :此负对照用来检验试剂污染情况.NTC 反应含有除模板以外的 所有组分.

7 疑难解答 问题 可能的原因及解决方案 没有 qPCR 产物或者 qPCR 产物出现很晚 RNA 模板不完整 RNA 的纯度和完整性对于 cDNA 的合成和定量至关重要. cDNA 合成之前需检测 RNA 的完整性(见第

5 页) . 按照所给的建议, 避免 RNA 污染 (第5页) 及弃掉低质量 RNA. 使用新鲜制备的 RNA. 不推荐使用多次反复冻融的 RNA 样本也 不建议多次冻融合成的 cDNA. 模板纯度低(RNA 样本中存在抑制剂) RNA 纯化过程中的残留试剂可能保留在溶液中,抑制第一链的 合成,如SDS、EDTA、胍盐、磷酸盐、焦磷酸盐、聚胺、亚精胺. 为去除残留污染物,重新用乙醇沉淀 RNA 并用 75%乙醇冲洗. 模板量不足 在第一链合成反应中按照推荐的水平增加 RNA 模板量.在DNase I 处理后,在存在 EDTA(结合 Mg2+ )条件下通过加热使酶失 活,以此来终止反应.若无螯合剂加入,加热时 RNA 会发生水解. 模板 GC 含量高 若RNA 模板富含 GC 或含有大量的二级结构,可将反应温度提 高至 65℃. qPCR 中加入过量的 cDNA 减少 qPCR/PCR 中cDNA 的量.加入的合成的 cDNA 产物体积 不应超过 PCR 反应总体积的 1/10. 在RT-minus 对照中 出现 RT-qPCR 产物 RNA 模板存在 DNA 污染 在负对照中出现 PCR 产物意味着反应中存在 DNA 污染. 为了避 免基因组 DNA 参与扩增, 在外显子-外显子边缘设计引物, 或者在反 转录前用 DNase I 消化.

8 参考文献 1. Wiame, I., et al., Irreversible heat inactivation of DNaseI without RNA degradation, BioTechniques, 29, 252-256, 2000. 2. Fleige, S., Pfaffl, M.W., RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance, Mol. Aspects Med., 27, 126-139, 2006. 3. Nolan, T., et al., Quantification of mRNA using real-time RT-PCR, Nat. Protoc., 1, 1559-1582, 2006. 注: 本产品或使用本产品都必须遵守美国专利申请 US20110251080A1 及相应的副本.购买 本产品包括购买非转让许可, 以便买方可将本产品用于其内部研究. 本产品的所有其他商业 用途,包括但不限于诊断用途、原装或改装转售或利用产品提供商业服务,均需要一份单独 的许可证.欲了解更多关于许可申请的信息,请联系 [email protected]. 产品使用限制 本产品的开发、 设计及销售专供研究和体外试验使用. 本产品不得用于诊断试验或药物 开发,也不适合向人或动物注射. 了解本产品的材料安全数据表,请浏览 www.thermoscientific.com/onebio. ?2012 Thermo Fisher Scientific 公司,版权所有.所有其他商标均归 Thermo Fisher Scientific 公司或其子公司所有.