PPT《H Cloning vectors》

H Cloning vectors Cloning vectors H1 design of plasmid vectors H2 bacteriophage vectors H3 cosmids and YACs and BACs H4 eukaryotic vectors Design of plasmid vectors Characteristics of plasmid vectorsAlteration of plasmid vectorsType of plasmid vectorsDevelopment of plasmid vector research Familiar plasmid vector Characteristics of plasmid vectors Independent from nuclear genomeAutonomously replicating nucleic acids sequenceGenetic stability Eukaryotic bacterial and epiphyte Most of plasmids consist of DNA.

Most of plasmids are cccDNA (covalent, closed, circle)Mw range :1 -

300 kb质粒的不相容性质粒的可转移性携带特殊的遗传标记 质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数(拷贝数)多寡,质粒可分为两大复制类型: ? 严紧型复制控制的质粒 stringent plasmid

1 -

3 拷贝 ? 松弛型复制控制的质粒 stringent plasmid

10 -

60 拷贝 质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒,不能同时存在于一个细胞中,这种现象称为质粒的不相容性,不相容性的质粒组成不相容性群以大肠杆菌的质粒为例: ? ColE

1、pMB1 拥有相似的复制子结构,不相容 ? pSC

101、F、RP4 拥有相似的复制子结构,不相容 ? p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构,不相容质粒不相容性的分子机制 质粒的可转移性 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类:接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞(接合作用),如F、Col、R质粒等非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用,如Col、R的其它成员值得注意的是,某些非接合型质粒(ColE1)在接合型质粒的存在和协助下,也能发生DNA转移,这个过程由 bom 和mob 基因决定 质粒的构建 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷,不能满足克隆载体的要求,因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建.目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的: ? pSC101:8.8 kb,拷贝数5,四环素抗性标记基因 Tcr ? ColE1:6.5 kb,拷贝数20 C 30,大肠杆菌内毒素标记基因 E1 ? RSF2124:ColE1衍生质粒,氨苄青霉素抗性标记基因 Apr 质粒的分类 人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类:高拷贝质粒:突变拷贝数控制基因,拷贝数1000-3000,扩增基因低拷贝质粒:来自pSC101,拷贝数小于10,表达某些毒性基因温敏质粒:在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒:含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒:装有整合促进基因及位点,便于外源基因的整合穿梭质粒:装有针对两种不同受体的复制子,便于基因克隆表达质粒:装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒:装有报告基因,便于启动子等元件的克隆筛选 发展概况 第一阶段(1977年前):天然质粒和重组质粒的利用,如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322.第二阶段:增大载体容量(降低载体长度),建立多克隆位点区和新的遗传标记基因.如pUC系列载体.第三阶段:完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求,如M13mp系列载体,含T3,T7,sp6启动子载体,表达型载体及各种探针型载体. Familiar plasmid vector pBR322Blue-white screeningpUC pUC18 / 19pKOpGEM-3Z pBR322 pBR322 has a circle dsDNA of 4.36kb, and the compositive base sequences have been found out.pBR322 has more than