PDF《欧美杨再生体系的建立》

150040 黑龙江省哈尔滨市和兴路26号 东北林业 大学林学院, Tel: 0451-82190232, E-mail: [email protected]. 收稿日期: 2016-06-24, 修回日期: 2016-08-29. 张瑞芝等: 欧美杨再生体系的建立 但杨树病害时有发生, 造成养护成本增加, 同时也影响 绿化效果.多种病菌可侵染杨树造成病害, 危害严重 的有: 杨褐盘二孢菌(Marssonina brunnea)引起的杨树 黑斑病、 东北球腔菌(Mycosphaerella mandshurica)引起 的杨树灰斑病、 链格孢菌(Alternaria tenuis)引起的杨叶 枯病、 茶子葡萄座腔菌(Botryosphaeria ribis)引起的 杨树溃疡病以及落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici- populina)引起的杨树叶锈病等. 落叶松-杨栅锈菌可侵染多种杨树, 所引起的杨树 锈病居杨树病害之首[2] , 分布甚广.目前杨树对叶锈 病的抗病性/感病性的先天免疫系统(innate immune system)应激反应过程尚不明确, 不同杨树品种对不同 锈菌的亲和关系(compatible interactions) 还有待验证.锈菌引起病原诱导的免疫反应(PAMP-triggered immunity, PTI)以及随即发生的效应因子诱导的感病 性(effector-triggered susceptibility, ETS)和效应因子诱 导免疫反应(effector-triggered immunity, ETI)还需要进 一步深入研究.黑杨(Populus nigra)具有对E1和E2型 锈菌的抗性[3] , 但以 E

1、 E2 和E3 型锈菌抗性树种为亲 本的杂交树种[4-5] , 无法抵抗E4型锈菌的侵染.作为黑 杨的杂交后代, 欧美杨既是E

1、 E2和E3型锈菌的抗性 树种, 又是 E4 型锈菌的感病树种.因此, 欧美杨是研 究杨树叶锈病的模式树种[6] .可为深入研究锈菌侵染 后杨树 PTI、 ETI 和ETS 等免疫过程提供良好的试验 材料. 杨树再生体系以叶片[7-9] 为主体材料, 亦可通过叶 柄[10-11] 、 茎段[12-13] 、 花药[14-15] 等器官和组织进行愈伤组织 诱导, 所得到的再生苗具有基因背景一致、 苗龄及生长 势统

一、 扩繁简便迅速以及方便基因转化等优点.因 此杨树再生苗是进一步研究杨树抗锈菌侵染分子机理 的基础, 有必要开展以欧美杨为代表的杨树叶锈病相 关树种的再生体系研究.

1 材料与方法 1.1 试验材料 选取 1~2 年生欧美杨沙培扦穗 (由东北林业大学 森保学科提供) 腋芽萌动初期的幼叶、 叶柄以及茎段 (含腋芽) 作为外植体. 1.2 外植体消毒 外植体用流水 (含2%的Tween-20) 将其表面及伤 口处所附着的杂物清洗干净.在超净工作台中, 将清 洗干净的外植体置于培养皿中, ddH2O 清洗

3 次, 70% 的酒精浸泡

10 s;

ddH2O 再次清洗

3 次, 1.5%的NaClO 浸泡

5 min;

ddH2O 清洗

6 次后用无菌滤纸将表面 擦干. 1.3 外植体培养 在超净工作台中, 用剪刀平行切割外植体.幼叶 和叶柄分别接入7种初代培养基(C1~C7)[9,16-18] , 幼叶面 积保持大约4 cm2 , 叶柄长度保持大约2 cm.茎段接入 4种初代培养基(C1~C4).方法如下: 用镊子将幼叶或 叶柄放在培养基表面, 轻轻按压边缘, 使其充分接触培 养基.将茎段插入再生体系瓶中, 保证茎段底部完全 接触培养基且腋芽发芽后不会沾到培养基.将接种好 的培养皿和再生体系瓶置于 25℃、 相对湿度 75%和光 照强度 1000~1500 lx(18 h/d)的培养条件下进行初代 培养. 1.4 继代培养 将外植体诱导产生的不定芽转入含有不同浓度的 6-BA 和NAA 的MS 培养基 (对照组, 加入 0.128 mg/L Cu2+ ) 上[19-21] , 培养条件与初代培养相同.20 天时进行 培养结果观察, 并统计分析不同浓度激素对丛生芽形 成的影响, 选取最优继代培养基. 1.5 抽茎培养 继代培养丛生芽长至 2~3 cm 时, 将其逐一分离. 每个丛生芽单株转入到含有不同浓度的6-BA和NAA 的MS 或1/2MS 抽茎培养基中[12,22-24] , 培养条件与初代 培养相同.14天后统计分析单株的抽茎率, 选择最优 的抽茎培养基. 1.6 生根培养 将抽茎培养获得的幼苗植株截取顶端2~3 cm, 插 入含有不同浓度的 NAA 的1/2MS 生根培养基中[25-26] . 置于25℃ , 相对湿度50% , 光照强度1000~1500 lx (18 h/d)的培养条件下进行生根培养.14 天后统计分 析幼苗的生根情况及生根率. 1.7 幼苗移栽 生根培养后, 幼苗生根, 生成完整的植株.选择根 系发达的植株从培养基中轻轻拿出, 将根部所有培养 基清洗干净, 放入自来水中培养3~5天.置于28℃, 相 对湿度 70%, 光照强度 1000~1500 lx(18 h/d)的条件下 进行培养.最后移栽入花盆中 (土:沙子:蛭石=3:2:1) , 给幼苗套袋, 10天后观察幼苗的存活率并摘去套袋.