PDF《ICS 11.020》

200 r/min 离心10 min分离血清. A.1.3 注意事项 取材前不要使用消毒剂, 取材时不要使用润滑剂. 疾病不同病期及病损不同形态影响病毒检测的敏 感性,应尽量取新出的水疱疱液或脓疱液进行检测. A.2 标本运送 取材后若不能立即进行检测,用于病毒培养的标本,应尽可能洗入病毒运送液中,弃去拭子,置冰 浴或4℃送检.用于免疫学或分子生物学方法检测的标本,置无菌密闭容器送检. A.3 标本保存 WS/T 236―2017

5 用于病毒培养的标本,取材当天(24 h内)接种者可暂置4 ℃冰箱保存;

如当天不能接种,置-70 ℃ 低温冰箱保存. 用于免疫学或分子生物学方法检测的标本, 需根据相应方法的要求处理标本,

2 ℃~8 ℃ 可保存48 h,更长时间保存需将标本冻存于-20 ℃或-70 ℃低温冰箱中. WS/T 236―2017

6 B C 附录B(规范性附录) 生殖器疱疹实验室检测方法 B.1 病毒培养、鉴定和分型 B.1.1 材料与仪器 材料与仪器准备如下: a) 敏感细胞株:常用的细胞系主要有非洲绿猴肾细胞(Vero)、宫颈癌细胞(HeLa). b) 细胞生长培养液:含10%小牛血清的 RPMI

1640 培养液.成分:RPMI

1640 16.4 g、庆大霉 素50 U/mL、二性霉素 B

2 μg/mL、胎牛或新生牛血清 10%、万古霉素

25 μg/mL、HEPES

25 mmol/L、碳酸氢钠 3.0 g、L-谷氨酰胺 0.2 mmol/L.配制时,双蒸水加至

1 000 mL,用碳酸 氢钠调节 pH 至7.2,正压过滤除菌,-20 ℃保存备用. c) 细胞生长维持液:含2%胎牛或新生牛血清的 RPMI

1640 维持液. d) 主要仪器:二氧化碳培养箱、倒置显微镜、恒温离心机、旋涡振荡器. B.1.2 方法 操作步骤如下: a) 单层细胞的准备.操作步骤如下: 1) 取出冻存细胞,置37 ℃水浴融化,加入已含有细胞生长培养液的培养瓶中,置37 ℃孵育8h,待细胞贴壁后换新鲜生长培养液,继续培养

2 d~3 d;

2) 细胞融合成单层后, 弃培养液, 用适量胰蛋白酶溶液于

37 ℃消化细胞单层

4 min~5 min, 让细胞完全离散后加入生长培养液,吸管吹打细胞使之均匀混悬;

3) 用血球计数器计数细胞,再以生长培养液作稀释,使其达到所需细胞浓度(大约

10 5 /mL), 分装于

24 孔培养板中,每孔加入 0.5 mL 细胞悬液;

4) 培养板置于 5% CO

2、37 ℃及湿润空气环境下培养

1 d~2 d,待80%的细胞融合,即细 胞基本长成单层后,用于标本接种. b) 标本接种.操作步骤如下: 1) 临床标本在旋涡振荡器上振荡混匀,冻存标本则从-70 ℃取出后立即置

37 ℃水浴融化, 混匀;

2) 吸去细胞单层的培养液,每孔加入标本 O.2 mL~O.5 mL,每份标本接种 1~2 孔;

3) 在5% CO

2、37 ℃环境中孵育

1 h~2 h,使病毒吸附到细胞上,吸去标本液,每孔加入 生长维持液 0.5 mL,在5% CO

2、37 ℃及湿润空气环境下培养

3 d~7 d. c) CPE 的观察.接种标本后每天观察 CPE,初步判断培养结果.培养结果阴性或可疑阳性者,应 观察至第

7 d,或者收集细胞及上清液,重新接种于新鲜细胞.CPE 记录方法如下: 1)

0 为无 CPE;

2) +为25%以下的细胞出现 CPE;

3) ++为25%~49%的细胞出现 CPE;

4) +++为50%~74%的细胞出现 CPE;

5) ++++为75%以上的细胞出现 CPE. WS/T 236―2017

7 d) 病毒传代.50%以上细胞出现 CPE 后收集培养物,再次接种至新鲜细胞中.当培养至 50%的 细胞出现 CPE 后,收集感染细胞及上清液.1

200 r/min 离心

10 min 后弃上清,用新鲜维持 液将沉淀物混悬,用于 HSV 鉴定及分型. e) 病毒临床分离株的鉴定和分型.常用单克隆抗体免疫荧光试验进行分型.取细胞悬液涂片,每 个标本均为双份,作HSV 鉴定和分型.直接免疫荧光试验分型操作方法如下: 1) 固定:用-20℃冷丙酮或甲醇固定标本