PDF《4卷第4期》

3 0

5 达 量增高, 半衰期延 长, 但不能引起人肺腺癌细胞 系A5

4 9的凋亡[ 因而我 们假设 E1 B的完 全缺 失可以使 EI A 的凋 亡诱导效应不被抵 消反而更显著. 构建了仅缺失 E1 B和E3区的重组 腺病 毒vSAd

4 , 其中EIA的表达被增强, 就其在癌细胞 表达 EI A. 研究其对正 常细胞 与肿瘤细 胞的影响.1材料 与方法I.I茁株. 细胞 、 病 毒与 质粒 E c o l i . T G1 , DH

5 t a 为本 室 保存 . 人肛 肾293细胞 购 自武 汉大学典型培养物 保藏中心 , D MEM 培 养基 加10%小牛 血清 常规培养 .人 肺腺 癌细胞系A549购 自上海 细 胞所 细胞库.RP MI

1 6

4 0培养 基加l0%小牛 血清 常规培 养 .正 常 人胚| i I i 细胞 由湖北 医科大 学 董长垣 教授惠赠 , DMEM 培 养基 加10%马 血清 常规 培养 .野生 型腺 病毒 5型 由南京 军事 压学科学 研 究所 邓小 昭教授 惠赠 .含ElA基 因 的质 粒pCMVE

1 A由 美国 P x u r g e r s 大学 E l l e e nWh i t e 博 士惠赠 . 质粒 p B HG

1 1【 E

1 一E3一一.腺 病毒 5型 基因组 E1 区的 棱苷酸 序列

1 8

8 ~1

3 3

9 b p ( o .

5 ~3 .

7 i a t

1 ) 被缺失, 一个 氨卞抗性 基因(Ap ) 和 一个细 菌的复制起始位点 ( 0r i ) 取代了这 区域. 同时 缺失 了病 毒DNA必需 的包装 信号 顺式 元件 因子 . 因 而在 单 独感 染293细 胞 时没 有感染性 .另外 , 此 质粒 中腺 病毒 5型E3区亦 被缺 失】、pCA1

3 【 E1 一E3一+.含 有腺 病毒5型基 因组

2 2 ~5

7 9 0b p ( o -1

6 I mu ) 核 苷酸序 列.但其中包含 一个

3 4

2 - -3

5 2

3 b p (

1 .

0 ~9 .

8 mu ) 的 序计缺 失 .缺失 区 内是 一个 用于外 源 片段插 入 的置于 H C MV I E启动 子( 一2

9 9 - - +7

2 b p ) 控制下的多 克隆 位点, 并跟 随有SV40poly(A) 信号],购自加拿 大Mi c mb i x B k ~ y s t o ms I NC .

1 .

2 酶和化学 试剂lipo{ectin、T4连 接酶、IPTG、 ~ - g a l 购自GI I EO 公司.限 制性内切 酶、马血清、RPMI I

6 4

0 培养基、DMEM 培 养基 购 自华美生物 制 品公 司.一般 化学试 剂均 为 国产分 折纯 .

1 .

3 质粒DN A的提取 、 酶切 . DN A片段的回收与 连接 按分 子克 隆 的常规程 序.稍作改 动.1.4重组 DN A的转化 和 阳性重组 子 的筛选 连 接产 物CaCI2法转化大 肠 杆菌 T G

1 . 通过 限制 性酶 切 消化 鉴定插 入片 段大 小来 筛选 阳性重 组体

1 .

5 共转染 通过 I i p o d n介导 , 将 含有 E I A表达 盒的转 移载 体pCAE1A和 p B HGI I共转 染293细 胞 .具 体操 作为:将]ipofectin17与pCAE1 A

2 0 P g及pBHG1

1 2

0 g分别用200无血清无 双抗(青霉索、链霉 索)DME M 培 养基稀 释, 室 温静置 l

5 ~3 0r ai n后, 将lipofe~tin逐 滴加 入稀 释好 的 质粒 中 井轻 轻 混合 均匀.室 温静 置30~4

5 r a i n使lipofectin包裹 DN A.朴加13mLDME M 培 养基, 使转 染 混合 液 体积 能均 匀覆盖细胞 层, 混匀 .将此 l i p o f e c t i n - DNA转 染混 合液缓 慢加 入经 无血清 无双 抗DME M 培 养基 轻洗过 的293细胞 .温浴6~8 h . 弃去旧培 养基 , 换 为含

5 %马血请 的DMEM 培养基继 续培养2~4 d , 观察 细 胞致 病效 应(cPE) .7 d 后, 取 上清再 次感 染293细胞 以扩增 重组病 毒.16重组腺病 毒和 野生 型腺 病毒 的感染 分 别取 收获的上 清3mL 加入A549细 胞及正常 人胚 肺 细胞 中,

3 7 ℃ 吸附