PPT《分子生物学实验》

分子生物学实验 主讲教师 石耀华 副教授应用专业:水产养殖学 日期:2010年9月5日 实验内容 实验一 动物基因组DNA提取 实验二 DNA琼脂糖凝胶电泳 实验三 DNA聚合酶链式反应 实验四 DNA的分离回收 实验五 DNA重组克隆与鉴定 实验六 动物总RNA的提取与mRNA的纯化 实验一 动物基因组DNA提取 1.

学习动物总DNA的抽提纯化的基本原理;

2. 掌握苯酚/氯仿法提取基因组DNA的基本技术. 【实验目的】 通过液氮研磨等将组织块打碎为单细胞或者小的细胞团,采用去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)等破坏细胞的膜结构,使细胞膜和核膜蛋白溶解,染色质的核蛋白释放,DNA游离出来.利用蛋白酶K在50 - 55℃下消化蛋白质组分.核酸是极性化合物,溶于水而不溶于酚、氯仿和乙醇等有机溶剂,而蛋白质具有苯酚、氯仿相似相溶性,而且苯酚和氯仿可以使蛋白质变性. 【实验的基本原理和基本知识 】 因此,可以采用苯酚/氯仿抽提蛋白酶消化后的匀浆液,然后根据苯酚/氯仿和水的密度差异进行离心分层,蛋白质分子溶于苯酚/氯仿相,而DNA溶于水相.水相密度较小,位于上层;

苯酚/氯仿相密度较大,位于下层.吸取上层的水相而放弃下层苯酚/氯仿相,从而除掉细胞内蛋白质等.进而利用核酸不溶于醇的性质将DNA从水溶液中沉淀分离出来,去除盐分等,再用适量的灭菌水或者TE溶液溶解

一、实验器材 水浴锅,离心机,移液器,解剖盘,剪刀,镊子,浮子,离心管架,1.5 ml离心管,10 μl、200 μl 和1 ml吸头及吸头盒,记号笔等

二、试剂 抽体液STE [10 mmol/ L Tris・HCl(pH 8.0),

10 mmol/ LEDTA (pH 8. 0),

100 mmol/ L NaCl,1% 2-巯基乙醇],10% SDS,蛋白酶K(20 mg/ml),苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),氯仿/异戊醇(24:1),无水乙醇,70%乙醇,TE等

三、实验材料 活鱼 【实验用品】 1. 剪取约0.2 g左右的鱼鳍组织,剪碎后置于加入了0.5 ml STE的1.5 ml灭菌离心管中;

2. 加入约65 μl的10% SDS至终浓度1%,然后加入5 -

10 μl蛋白酶K,盖好盖子后颠倒混匀;

3. 将上一步的样品置于浮子中,然后在预先调温为50 - 55℃的水浴锅中消化,每15 -

20 min迅速颠倒摇动数次;

4. 鳍条上的皮肤等完全脱落消化后取出样品,室温下*8 000g离心2 -

5 min;

5. 吸取上清至另一灭菌的1.5 ml离心管中,加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),颠倒混匀5-10 min;

6. 室温*13

000 g离心10 min;

【实验操作】 7. 吸取上清至另一灭菌的1.5 ml离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),颠倒混匀5 min;

8. 室温*13

000 g离心5 min;

9. 吸取上清至另一灭菌的1.5 ml离心管中,加入2倍体积的无水乙醇,颠倒混匀后静置约15 min;

10. 室温*13

000 g离心10 min;

11. 倒掉液体,加入1 ml 70%乙醇;

12. 室温*13

000 g离心5 min;

13. 重复步骤11和12;

14. 尽量倒干液体,室温干燥15 min;

15. 加入100 -

200 μl 或者TE溶解DNA沉淀;

16. 置于-20保存或者进行检测和其它实验. 1. 加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇经步骤6离心后,会分为三层,请问DNA和蛋白质分别位于哪一层?DNA可能在最下层吗?为什么?2. 本实验中氯仿、乙醇和SDS分别有什么作用?3. 如果分别以鱼的肝脏、血液、肌肉和鱼鳍组织为材料提取的DNA,所提取的DNA组成是否会相同?请说明理由. 【作业与思考】 实验二 DNA琼脂糖凝胶电泳 1. 了解DNA琼脂糖电泳的基本原理;