PPT《分子生物学实验》

【 PCR技术基本原理】 b.退火.快速降低温度,变性为单链状态的DNA因降温时间极端来不及彼此配对而仍然维持单链结构,使得反应体系中过量的单链状态的引物与模板DNA的靶序列按照碱基配对原则互补,形成局部的引物-模板DNA杂交双链.一般为37 - 65℃,因引物而异,退火时间通常为30秒;

c.延伸.反应体系的温度加热升至72℃左右,DNA聚合酶以单链DNA为模板、以4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)为原料、以引物-模板DNA杂交双链中的引物为起始点,按5'

-3'

方向逐渐复制出与模板互补的DNA区段. 退火Tm-5℃ 延伸72?C 变性95?C 循环 PCR扩增原理图

一、实验器材 移液器,PCR扩增仪,电子天平,电泳仪,电泳槽,凝胶成像系统,0.2 ml PCR管等

二、试剂上游引物,下游引物,dNTP,MgCl2,Taq酶,灭菌去离子水,反应缓冲液,上样缓冲液,EB,琼脂糖等

三、实验材料 动物DNA 【实验用品】 1. 配制PCR反应各种试剂混合液.每个反应总体积25 ?l,依次将各组分加入除菌的1.5 ml离心管中 0.5-1 U 0.2*n

7 DNA Taq聚合酶 0.2 ?mol/L 1*n

6 5 ?M下游引物 0.2 ?mol/L 1*n

5 5 ?M上游引物

200 ?mol/L 0.5*n

4 10 mmol/L dNTP 1.5 mmol/L 1.5*n

3 25 mmol/L MgCl2

1 x 2.5*n

2 10*Buffer 17.3*n

1 ddH2O 终浓度 体积/?l 加样顺序 反应物 【实验操作】 2. 轻弹离心管,混匀反应混合液,瞬间低速离心,将管壁上的混合液离心至管底,然后将反应混合液分装至0.2 ml的PCR薄壁管中,每管24 ?l;

3. 向每个PCR薄壁管中加入1 ?l模板DNA,盖好管盖;

4. 将加好试剂的PCR薄壁管置于PCR仪中,设置PCR程序;

35个循环 94℃

4 min (预变性) 94℃

30 sec,Tm

30 sec,72℃ 0.5-2 min 72℃

10 min 5. 按start启动PCR仪,启动循环扩增;

1. PCR 扩增时引物的作用是什么?如何才能设计出好的引物?2. PCR扩增时每个循环均在三个不同的温度保持了较长的时间,请说明这三个不同温度的作用.3. 每个循环的变性阶段到退火阶段要迅速地降温,为什么?4. PCR反应涉及了许多试剂组分,试说明各主要成分在PCR反应过程中所起的作用. 【作业与思考】 实验四 DNA的分离回收 1. 了解琼脂糖中回收纯化DNA的基本原理;

2. 学习掌握琼脂糖电泳分离DNA回收纯化的常见方法. 【实验目的】 不同大小的DNA分子琼脂糖电泳后形成彼此分离的DNA条带,据此,溶液中分子量不同的DNA分子可以借助琼脂糖电泳实现彼此分离,进而可以将包埋了单一分子量DNA的琼脂糖凝胶条带切割下来,采用低熔点琼脂糖凝胶法、玻璃奶(Glassmilk)回收法、冻融法和电洗脱法等回收.低熔点琼脂糖凝胶法 是在电泳分离DNA时将目的DNA电泳至熔点约37℃的低熔点胶中,然后利用凝胶容易融化的特性,65℃左右水浴融化后采用酚/氯仿法抽提纯化.玻璃奶法 利用碘化钠(NaI)降低琼脂糖熔点,55℃左右水浴融化凝胶,然后利用玻璃奶颗粒小、表面积大、吸附能力强的特点,改变溶液条件,使DNA由溶液状态转变为不溶丝状而被吸附至玻璃奶颗粒表面,洗涤除掉盐分等杂质后再用TE或者除菌水洗脱DNA. 【基本原理】 冻融法 是将切下的凝胶挤压研碎后将酚/氯仿法和-20℃冷冻条件相结合,重复提取其中的DNA.电洗脱法 利用电场力的作用,使DNA自切割下来的固体琼脂糖中电泳至被包裹的透析袋溶液中,DNA分子小于透析袋孔径而留存在透析袋中,进而用常规酚/氯仿法抽提纯化. 目前,为了更加快捷有效地分离回收琼脂糖中的DNA,避免使用有毒试剂酚和氯仿,以吸附DNA的特殊硅胶树脂为填充物、采用过柱离心方式分离DNA的试剂盒普遍得到使用.尽管不同公司的试剂盒具体的试剂可能有所不同,但是均是先采用类似于玻璃奶法的碘化钠(NaI)等试剂降低琼脂糖熔点,50℃左右水浴溶胶后再利用树脂等DNA物理吸附材料过柱漂洗和洗脱,实现DNA的回收纯化.