PPT《分子生物学实验》

2. 掌握琼脂糖电泳的基本操作和结果判读方法. 【实验目的】 琼脂糖(Agarose)是从石花菜或者其它红藻植物提取的中性不带电荷成份,凝固点较低,与水一起加热融化后,室温下半小时左右就可以凝固形成从50 nm到数百纳米孔径的凝胶状固形物,孔径的大小与琼脂糖的浓度成反比.核酸分子带负电,将其加样于浸没在电泳缓冲液里的琼脂糖凝胶中,两端加上适当的电压时,核酸分子就会在电场力的作用下由阴极向阳极移动.在同一电场条件下,不同的核酸分子因分子量大小、电荷和构象等不同具有不同的运动能力,迁移速率存在差异,据此,可以将混合在一起的核酸分子分离开. 【基本原理】 琼脂糖凝胶的浓度与分离的线状DNA分子量范围 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-4 0.1-3 DNA分子量(kb) 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 琼脂糖浓度 (%)

6 5

4 3

2 1 序号

一、实验器材 电子天平,微波炉,电泳仪,水平板电泳槽,三角烧瓶,制胶板和梳子,微量移液器,凝胶成像系统等

二、试剂 琼脂糖,DNA分子量标准,0.5*TBE,6*上样缓冲液,溴化乙锭(水中加入溴化乙啶,搅拌数小时至溶解,配制为10 mg/ml,棕色瓶中室温或者4℃保存) 等

三、实验材料 DNA溶液 【实验用品】 称样 溶解 加热 制板 倒胶 电泳操作基本程序 取样 点样 电泳 检测 1. 根据样品数量确定制备琼脂糖凝胶所需的溶液体积(假定为100 ml),按照1%的比例(质量提积比)称取琼脂糖粉末1 g,倒入250 ml的三角烧瓶中;

2. 量取100 ml 的0.5*TBE缓冲液,加入三角烧瓶中,微波炉加热至完全溶解(中高火约3 min),室温或者冷水中冷却至55℃左右(烫手但是仍然可以用手握住),加入千分之一的EB溶液,至终浓度为的0.5 -

1 ?g/ml;

3. 封好制胶盘,插好梳子,将凝胶缓缓倒入制胶板中至凝胶厚度3-5mm;

4. 室温放置半小时以上,凝胶充分冷却凝固后,连同托板一起转移至电泳槽中;

5. 向电泳槽中加入0.5*TBE至缓冲液高出凝胶面2 -

5 mm,轻轻拔出梳子;

【实验操作】 6. 取1 ?l DNA样品、6 ?l灭菌去离子水和2 ?l 6*上样缓冲液,混匀;

7. 将制备好的DNA和上样缓冲液混合液小心地加入点样孔中,并在凝胶两侧的点样孔中各加入约20 ng的λDNA(或者其它DNA marker,例如λDNA的EcoRI、HindIII双酶切marker);

8. 盖好电泳槽,接通电源,恒压(按正负极间距离每厘米3 -

5 V设定)电泳;

9. 当溴酚蓝距离凝胶阳极端约1 cm时关闭电源,停止电泳;

10. 取出凝胶,凝胶成像系统中观察和拍照;

11. 将凝胶收集至三角烧瓶中重复利用,软纸擦拭干净凝胶成像系统的观察台,关闭凝胶成像系统. 1. DNA琼脂糖凝胶迁移率受哪些因素的影响?具体说说影响的结果.2. 发表的论文中核酸琼脂糖凝胶电泳图片常常是核酸呈现白色、凝胶呈黑色或者深灰色,你观察到的核酸是否与此颜色相同?为什么?3. 依据你的电泳结果判断你提取的DNA是否降解了,并说明理由. 【作业与思考】 实验三 DNA聚合酶链式反应 1. 了解DNA聚合酶链式反应的基本原理;

2. 学习引物设计的基本原则;

3. 熟悉常规PCR仪器的使用操作. 【实验目的】 DNA聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, 简称PCR)1983年由美国Cetus公司的Kary Banks Mullis发明.PCR技术是一个不断重复的循环过程,每一个循环包括变性、退火和延伸三个基本步骤:a.变性.人工加热使模板DNA双链配对碱基间的氢键断裂,DNA双链解开为两条单链,一般采用94-95℃左右的高温处理10 - 30秒;